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文中如未特别指出,PCR程序均为:95℃预变性5,95℃变性30,60℃退火30, 72℃延伸130 (短片段30), 30个循环后延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
载体构建及鉴定
1.PCR产物的纯化
参见安比奥生物科技公司的Puprep PCR Purification Kit 说明书。
2. 载体构建(Gateway技术)
pDONR201是一种attP供体载体,用于BP反应构建入门载体,包含抗kan和抗cm筛选标记,并且含有 ccdB基因,ccdB基因编码干扰大肠杆菌DNA促旋酶的一种蛋白,从而抑制标准大肠杆菌宿主的生长。当目的载体和入门克隆发生重组时,ccdB基因被目的基因取代。携带有ccdB基因的未反应载体或保留有ccdB基因副产品的细胞将不会生长。
GatewayN-GFP一种attR目的载体通过LR反应构建目的基因的表达载体(图3.3),含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar,还含有绿色荧光蛋白报告基因GFP。
表达载体Gatewaypleela(图2.2)含有35S组成型强启动子、抗氨苄青霉素基因和抗除草剂筛选标记基因Bar,通过LR反应构建目的基因的表达载体。
图2.2 pDONR201的结构
BP反应体系 (attB x attP → attL x attR )
attB-PCR产物 40-100 fmol,25-50ng
pDONR? 75ng
5x BP Clonase?- buffer 1 μl
TE Buffer (pH 8.0) or H2O to 4.5μl
BP Clonase? 0 .5μl
Total 5μl
反应体系放于25°C下温育2h。反应后,加2 μl 2 μg/μl的Proteinase K在37°C下处理10 min,再将BP产物(入门载体)加2μl转入大肠杆菌DH5α,在含kan的LB板上筛选,克隆并保存入门载体。
LR反应体系 (attL x attR → attB x attP )
入门载体 25-50ng
目的载体 75ng
5x LR Clonase? -buffer 1μl
TE Buffer(pH 8.0) or H2O to 4.5 μl
LR Clonase? 0.5μl
Total 5 μl
体系放于25°C下温育2h,反应后,加2 μl 2 μg/μl的Proteinase K在37°C下处理10 min,再将2 μl反应产物(表达载体)转入大肠杆菌DH5α在含AmpLB板上筛选,克隆并保存入门载体。
3.质粒提取(安比奥试剂盒说明书)
将含有目的质粒的细菌接种到2-5ml的LB培养基中,37度培养12-16h,取菌液1.5-6ml于干净的1.5mlEP管中10000rpm 1min。
将细菌重悬于buffer 250ul PB1中(已加RNAase),窝旋振荡,务必使细菌充分分散。
加入250ul buffer PB2 ,轻轻颠倒离心管4-6次。使溶液充分混允。使溶液澄清,一般反映不要超过5min。
加入350ul buffer NB3, 轻轻颠倒离心管4-6次。使溶液充分混允,静置3-5min.
14000rpm离心10min,将上清转移到含收集管的离心柱内。
1000-12000rpm 离心1min,倒去收集管内的液体,并将离心管重新放回离心柱内。
加入0.5ml的buffer PB4于离心柱内,1000-12000rpm 离心1min,倒去收集管内的液体,并将离心管重新放回离心柱内。
加入750ul的buffer WB于离心柱内, 1000-12000rpm 离心1min,倒去收集管内的液体,并将离心管重新放回离心柱内。
重复8一次。
高速离心(13000-14000rpm)2min, 将离心柱盖子打开在室温下风干5-10min后置于一干净的1.5ml的离心管中。
加入50ul buffer EB或者是PC
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