实验3ELISA法测定乙肝__培训课件.pptVIP

实验七 ELISA法测定乙肝 ：是指用可微量测定的标记物（放射性核素、荧光素、酶等）对抗原或抗体进行标记，并在标记免疫物质反应结合后，测定结合物中的标记物来反映抗原-抗体反应的检测技术。 目前最常用的是酶标记免疫技术、荧光标记免疫技术、放射性核素标记技术。这类免疫标记技术的应用极大程度地提高了抗原-抗体反应的检测敏感性。 酶标记免疫技术 以酶作为标记物，通过显色反应指示抗原-抗体反应的标记技术称为酶免疫技术。 可分为酶免疫组织化学技术和酶免疫测定技术两大类。目前应用最广的为酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）,是免疫测定技术的代表。 酶联免疫吸附试验 （ELISA） 掌握酶联免疫吸附试验的原理、方法和结果判断及临床应用。 实验目的： 将抗原（或抗体）结合于某种固相载体的表面，并保持免疫活性，再以标本中的待检抗体（或抗原）与之结合，然后使酶标抗体与已形成的抗原抗体复合物结合，分别洗去未结合的抗原与抗体，最后加入酶反应的底物，出现呈色反应，该反应中的有色产物含量与待检抗体（抗原）的含量直接相关。 实验原理： ELISA测定方法有： 间接法：检测抗体最常用的方法； 双抗体夹心法：检测抗原最常用的方法； 竞争法：既可用于测抗原，又可用于测抗体； （1）间接法测定抗体 A. 将抗原吸附于固相载体表面(试剂盒生产厂家已经做好）； B.加抗体, 形成抗原-抗体复合物?; C.??加酶标抗体（多为37℃孵育） ； D.洗液洗去多余?未结合酶标抗体 E.加底物,显色反应， 测定底物的降解量和抗体量有关。 （2）双抗体夹心法测定抗原 A.????? 将抗体吸附于固相表面; B.????? 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C.???? 加酶标抗体; D. 洗液洗去多余?未结合酶标抗体 E. 加底物显色。底物的降解量与抗原量有关。 （3）竞争法测定抗原 A.?将抗体吸附在固相载体表面; B.加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差＝未知抗原量。 乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒 测定原理： 采用单克隆抗-HBs（ HBs Ab）包被反应板，加入待测标本，同时加入多克隆抗HBs-HRP（辣根过氧化物酶）,当标本中存在HBs Ag时，该HBs Ag与包被抗-HBs结合并与抗HBs-HRP结合形成抗-HBs- HBs Ag-抗HBs-HRP复合物，加入显色TMB（四甲基联苯胺）底物产生显色反应，反之则无显色反应。 试剂盒组成： 1.包被好的微孔反应板 2.酶结合物 3.阳性对照 4.阴性对照 5.洗涤液 6.显色剂A、B 测定步骤 1.每孔加入待测样本50μl，设阴性、阳性对照孔，每孔加入阴性对照（或阳性对照）各一滴，并设空白对照1孔。 2.每孔加入酶结合物一滴（空白对照孔除外），充分混匀封板，置37℃孵育30分钟。 3.手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。洗板机洗板：选择5次程序洗板后拍干。 4.每孔加入显色剂A、B液各一滴，充分混匀，封板，置37 ℃孵育15分钟。 5.用酶标仪读数，取波长450nm,先用空白孔较零，然后读取各孔OD值。 结果判断： 判断为阳性，否则为阴性。 阴性对照OD值低于0.05时作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。 样品OD值 阴性对照平均OD值 2.1 HBV抗原抗体检测结果的临床分析 HBsAg HBeAg 抗-HBs 抗-HBe 抗-HBc 结果分析 ＋ － － － － HBV感染或无症状携带 ＋ ＋ － － － 急慢性乙肝或无症状携带 ＋ ＋ － － ＋ 急慢性乙肝（大三阳） ＋ － － ＋ ＋ 趋于恢复（小三阳） － － ＋ ＋ ＋ － － ＋ ＋ － 既往感染恢复期 － － － － ＋ 感染过HBV － － ＋ － －