5高效液相色谱精篇课件.ppt

色 谱 分 析 主讲：付大友 内容 §1 绪 论 §2 色谱理论基础 §3 色谱定性定量方法 §4 气相色谱分析 §5 高效液相色谱分析 §6 超临界流体色谱和毛细管电泳 §7 色谱联用简介 §8 计算机技术在色谱分析中的应用 §5 高效液相色谱分析 高效液相色谱法的出现及特点 高效液相色谱仪器结构 高效液相色谱基本原理 高效液相色谱固定相和流动相 高效液相色谱梯度洗脱技术 高效液相色谱类型简介 高效液相色谱法的出现 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。 高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 stein和Moore获得了1972年的诺贝尔化学奖 （研制出氨基酸分析仪 ） 高效液相色谱法的特点 与气相色谱相比 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2)气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了极大方便。 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 §5-2高效液相色谱仪器结构 色谱仪器的流程由液体流动相的输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、信号放大记录系统组成，其中高压泵、色谱柱和检测系统是高效液相色谱的主要部件。 输液系统 包括流动相储液瓶、过滤器、脱气装置、高压泵、压力脉动阻尼器、梯度洗脱装置等部件组成 脱气装置 常用的脱气方法有： 低压脱气法：电磁搅拌、水泵抽空，可同时加温或向溶剂吹氮。由于抽空或加热过程中可能引起流动相中低沸点溶剂的挥发而影响其组成，此法不适于二元以上溶剂组成的流动相脱气。 吹氦脱气法：氦气经由一圆筒过滤器通入冲洗剂中，在0.5公斤／厘米压力下保持10~15分钟，氦气的小气泡可将溶于流动相中的空气带出，此法简单方便，适用于所有冲洗剂脱气，但由于氦气价格昂贵，在国内尚难于普及。 超声波脱气法：将溶剂储液瓶置于超声波清洗槽中，以水为介质超声脱气。一般500毫升溶剂约需超声20~30分钟即可达到驱气目的。此法方便，不影响溶剂组成，并适用于各种溶剂，目前国内使用较为普遍。 高压泵 目前高效液相色谱使用的高压泵分为恒压和恒流泵，桓流泵使输出的液体流量稳定，而恒压泵则使输出的液体压力稳定。桓流泵中有往复泵、累积型往复泵、注射泵，恒压泵有气动放大泵。各种高压泵均具有以下性能： 泵体材料能耐化学腐蚀。通常使用普通耐酸不锈钢或优质耐酸不锈钢。为防止酸、碱缓冲溶液的腐蚀，在离子色谱或亲和色谱分析中现已使用由聚醚醚酮(PEEK)材料制成的高压输液泵。 能在高压下连续上作。通常要求耐压40~50MPa·cm-2，能在8~24h连续上作。 输出流量范围宽。一般在0.01~10mL/min。 输出流量稳定，重复性高。高效液相色谱使用的检测器，大多数对流量变化敏感，高压输液泵应提供无脉冲流量。这样可以降低基线噪声并获较好的检测下限，流量控制的精密度应小于1％，最好为0.5％，重复性最好为0.5％。 往复泵 累积型往复泵 累积型往复泵有两个泵头，以串联方式连接在一起，这样可以提供平稳的液流。所以如此是因为两级泵腔排液体积不同，第一级泵腔是第二级泵控的一倍． 注射泵 注射泵类似于注射器，用一