05核口酸分离检测.pptVIP

第五章核酸的分离与检测 一、核酸的分离、提取通则 核酸在细胞中通常与各种蛋白质结合在一起。 分离原则：保证核酸分子一级结构的完整性；排除其他分子污染。 分离与纯化的方法一般包括细胞裂解、酶处理、核酸与其他生物大分子物质分离、核酸纯化等几个主要步骤。 1. 细胞裂解 机械作用：低渗、超声、微波、冻融裂解和颗粒破碎等。不适于高分子量长链核酸的分离。 化学作用：一定p H 和变性条件下，细胞破裂，蛋白变性沉淀，核酸→水相。变性条件：加热、表面活性剂(SDS、Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 等) 、强离子剂(异硫氰酸胍、盐酸胍等) 。p H 环境：强碱(NaOH) 或缓冲液 ( TE、STE 等)。 金属离子螯合剂( EDTA 等) 螯合Mg2+ 、Ca2+，抑制核酸酶活性。 酶作用：溶菌酶或蛋白酶(蛋白酶K、植物蛋白酶或链酶蛋白酶)破裂细胞。降解与核酸结合的蛋白质，促进核酸的分离。 联合使用：细胞、待分离核酸类型及后续实验目。 2. 酶处理 裂解液中加入蛋白酶（蛋白酶K 或链酶蛋白酶） ，降解蛋白质；灭活核酸酶（DNase 和RNase） 加入DNase 和RNase 去除不需要的核酸。 防止核酸的降解和变性 防止过酸、过碱对磷酸二酯键的破坏（一般在 pH 4-10下进行） ; 避免剧烈搅拌； 防止核酸酶（DNase , R