【2017年整理】逆转录PCR讲义.docVIP

逆转录—巢式RT-PCR） 一、实验目的： 学习RT-PCR反应的基本原理。 掌握血液等液体标本中提取RNA并逆转录的技术。 了解其他标本（如组织块）中提取RNA的技术。 二、实验原理 RT-PCR是将RNA的转录RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经转录酶的作用RNA为模板合成cDNA，再以cDNA为模板扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。PCR扩增仪高速冷冻离心机台式高速离心机Vortex震荡混匀器水平电泳仪凝胶成像系统电热恒温水浴锅TRIzol ReagentTM、AMV逆转录酶RNA酶抑制剂Taq DNA聚合酶MgCl2）、dNTP Mixture，10 mmol/L琼脂糖溴化乙锭DNA Marker、三氯甲烷（氯仿）异丙醇DEPC*（）处理水：加100μl DEPC于100ml超纯水中，使DEPC的体积分数为0.1%，室温震荡至少4h；然后高压蒸汽灭菌20min。溶解RNA所需的DEPC水用无RNase的1.5ml 微量离心管分装，-20℃保存；用于配置75%乙醇的DEPC水则直接置于4℃保存。 75%乙醇溶液：取75ml无水乙醇用DEPC处理水定容至100ml，4℃保存。所用容器及量筒均需洗净后200℃干烘8h。病毒RNA的提取将待测标本、阳性对照取出解冻；再取出2套RNase-free（无RNase）的1.5ml微量离心管和2支RNase-free的0.5ml微量离心管，并进行标记； 取一套标记好的离心管，每管加入TRIzol 500μl，再加入100μl血清/等标本和对照（阴性对照最先加，标本居中，阳性对照最后加；注意将枪尖伸至TRIzol中），用Vortex震荡混匀5sec（液体无明显分层），室温静置5min； 每管加入氯仿100μl（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），用Vortex震荡混匀15sec（液体无明显分层），室温静置3min； 4℃、12000rpm离心15min；待离心结束后，小心吸取上层水相至另一套标记好的RNase-free的1.5ml 离心管，加入等体积异丙醇（根据吸取的量估算，可适当多加一些；注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），颠倒混匀，室温静置15-30min；同时，确认水浴锅已打开； 4℃、12000rpm离心10min；待离心结束后，直接倒去上清每管加入75%乙醇500μl重悬沉淀（注意沿着管壁加液，避免液体飞溅），轻柔颠倒混匀5次；与此同时，取出、RNasin、5×RT Buffer、dNTP Mix解冻 4℃、8000rpm离心5min；待离心结束后，倒去上清；用瞬时离心机简短离心1-2s，仔细观察沉淀位置，沿管壁吸出底部残余液体；室温晾干5-10min（应防止过分干燥） 最后加入20μl 溶解RNA沉淀℃备用。 逆转录（RT）在.5ml RNase-free（无RNase）的微量离心管中依次加入： DEPC处理水μl 外循环下游引物（20pmol/μl）0.6μl RNA酶抑制剂（40U/μl）0.1μl 总体积 9.7μl 再加入RNA溶液5μl，70℃水浴5min，再冰浴5min； 再依次加入： 5×AMV逆转录反应缓冲液μl dNTP Mixture（10mol/L）1.0μl RNA酶抑制剂（40U/μl）0.1μl AMV逆转录酶（5U/μl）0.2μl 总体积μl 42℃温育40min。 巢式PCR（nested PCR）第一轮PCR扩增体系为： 10×PCR反应缓冲液2.0μl MgCl2（25mol/L）1.2μl dNTP Mixture（10mol/L）0.2μl 上游引物（20 pmol/μl）0.2μl 下游引物（20 pmol/μl）0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl cDNA 2.0μl dd H2O补足反应体积至20μl 第二轮PCR扩增体系为： 10×PCR反应缓冲液2.0μl MgCl2（25mol/L）1.2μl dNTP Mixture（10mol/L）0.2μl 上游引物（20 pmol/μl）0.2μl 下游引物（20 pmol/μl）0.2μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）0.2μl 第一轮PCR产物2.0μl dd H2O补足反应体积至20μl PCR仪扩增条件为： 94℃ 预变性 5min 94℃ 变性 30s 53℃ 复性 30s 35个循环 72℃