大肠杆菌发酵种子的制备课件.pptVIP

大肠杆菌发酵种子的制备 种子扩大培养的目的与要求 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平 总量及浓度能满足要求 生理状况稳定 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染 种子的扩大培养-培养基 斜面： 肉膏蛋白胨培养基（蛋白胨1%、牛肉膏1%、NaCl0.5%、琼脂2%、pH7.0～7.2） 培养基特点：有利于菌体生长，原料比较精细 生长斜面要求：菌体生长良好 一级种子：胰化蛋白胨 1%，酵母提取物 0.5%，NaCl 1%，pH7.0 培养基特点：有利于菌体生长，原料基本接近发酵培养基 二级种子： 同一级种子培养基 培养基特点：长菌体，原料更接近发酵培养基 菌种 斜面 一级种子 二级种子 按学号，4人一组，3组共用一支斜面种子 摇瓶装液量25ml 一级种子种龄在14h±2h内，二级种子7-8h内 30℃，18h ，4℃保存3-6个月 14h，32℃，200rpm 8h，32℃,200rpm 接种量1-2环 接种量1% 时间安排 ? ? 一级种子 二级种子 ? 配培养基灭菌 接种 结束 接种 结束 灭菌 时间 10:30 14:00 8:00 13:00 21:00 15:00 OD420nm 稀释倍数 ? 无 1 ? ? ? pH ? 1 2 3 4 ? 镜检 ? 大小形状，颜色, 绘图 大小形状，颜色， 绘图 大小形状，颜色， 绘图 大小形状，颜色， 绘图 ? 无 0 2 无 每一格必须由操作人签名！ 无 无 无 无 镜检：革兰氏染色 写上组号，上交，每组交三片，写上时间，组号。作为评分依据。 大肠杆菌是G-菌 步骤：初染、媒染、脱色、复染 1、? 涂片固定 2、? 草酸铵结晶紫染1min 3、? 自来水冲洗 4、? 加碘液覆盖涂面染1min 5、? 水洗，用吸水纸吸去水分 6、? 加95%酒精数滴，轻轻摇动脱色，30s后水洗，吸去水分。 7、? 番红染色液染1min，自来水冲洗，干燥，镜检。 阳性呈紫色，阴性呈红色。 pH 测量方法：pH计。 pH的变化理论上为： 初期，菌体生长期，菌体利用营养物质释放酸，使pH↓ 中期，产物合成期，pH相对稳定 后期，菌体自溶期，氨基氮↑，pH↑ 生物量测定——浊度法 OD测浊度： 分光光度计使用前预热20min。 在420nm处测量 为了使OD值与浓度成线性关系，应稀释，保证OD值小于0.5，把稀释倍数也记录在表格里，理论上，二级种子结束时的OD应大于一级种子。 稀释5倍或10倍甚至更多。 灭过菌的空白培养基作参比液,稀释相同倍数。 实验室安排 每组领一台显微镜，放在510 接种 502 灭菌 504 摇床 510 分光光度计 509 pH 应该2比1小，4比3小，如果大了，说明培养过头，已经发生菌体自溶现象。 为了解发酵过程中培养菌的生长及对培养基的利用情况，需在发酵过程中定时地取样测定，绘制代谢曲线。 代谢曲线是指发酵过程中发酵参数随时间变化的曲线，通过代谢曲线的测定，能够准确地掌握发酵过程中各参数的变化状况，并通过采取一定的措施对部分发酵参数进行调整以满足发酵合成代谢产物的需要。通过与典型代谢曲线的比较，通常也可以判断发酵进行是否正常。例如，溶氧可以作为了解菌对O2的利用规律，了解发酵是否异常，供O2与产物合成关系等的重要指标。 本实验通过测定发酵过程中pH、溶氧及菌含量绘出上述各参数与发酵时间的关系图——即发酵代谢曲线。 * 革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。 * pH 应该2比1小，4比3小，如果大了，说明培养过头，已经发生菌体自溶现象。 为了解发酵过程中培养菌的生长及对培养基的利用情况，需在发酵过程中定时地取样测定，绘制代谢曲线。 代谢曲线是指发酵过程中发酵参数随时间变化的曲线，通过代谢曲线的测定，能够准确地掌握发酵过程中各参数的变化状况，并通过采取一定的措施对部分发酵参数进行调整以满足发酵合成代谢产物的需要。通过与典型代谢曲线的比较，通常也可以判断发酵进行是否正常。例如，溶氧可以作为了解菌对O2的利用规律，了解发酵是否异常，供O2与产物合成关系等的重要指标。 本实验通过测定发酵过程中pH、溶氧及菌含量绘出上述各参数与发酵时间的关系图——即发酵代谢曲线。 * 革兰氏阳性细