第二章核酸分子杂交-副本解决方案.pptVIP

与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点： 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。 RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。 RPA的缺点是需要同位素标记探针。 （三）引物延伸分析法（primer extension analysis） 可用于RNA 5’端的定位和定量，确定转录的精确起始。并可检测mRNA前体和剪接加工中间体。 待测RNA与过量的5’端标记的单链DNA引物杂交，随后用反转录酶延伸引物，合成与RNA互补的cDNA。通过变性的PAGE检测cDNA的长度，即可反映引物末端的标记核苷酸与RNA 5’端的距离。 * 尽管取得了上述重大进展，但分子杂交技术在临床实用中仍存在不少问题，必须提高检测单拷贝基因的敏感性，用非放射性物质代替放射性同位素标记探针以及简化实验操作和缩短杂交时间，这样，就需要在以下三方面着手研究：第一，完善非放射性标记探针；第二，靶序列和探针的扩增以及信号的放大；第三，发展简单的杂交方式，只有这样，才能使DNA探针实验做到简便、快速、低廉和安全。 * 一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。 * * * * * * * * * 噬菌斑杂交法 plaque bybridization 噬菌斑原位杂交至今仍为从噬菌体文库中筛选重组子的一项最为通用的技术。 将在琼脂培养基上形成的噬菌体的噬菌斑，移于硝酸纤维素滤纸上，碱处理使噬菌体DNA变性； DNA固定于硝酸纤维素滤纸上，与用放射性同位素标记的特定的RNA或DNA片段进行杂交； 通过放射自显影法来识别含有所需DNA序列的噬菌体的噬菌斑，并从原来的琼脂培养基中选出与其对应的噬菌斑。 （二）荧光原位杂交 （Fluorescence in situ hybridization，FISH），是一种重要的非放射性原位杂交技术，对于研究细胞的生物学功能、基因表达的规律以及病原微生物的检测等，都有重要意义。 原理 FISH(fluorescence in situ hybridization)技术是一种重要的非放射性原位杂交技术。它的基本原理是:如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。 实验流程：FISH样本的制备→探针的制备→探针标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微镜检测→结果分析 FISH技术的优点：1.荧光试剂和探针经济、安全；2.探针稳定，一次标记后可在两年内使用；3.实验周期短、能迅速得到结果，特异性好，定位准确；4.可定位长度在1kb的DNA序列，其灵敏度与放射性探针相当；5.多色FISH可同时检测多种序列；6.既可以在玻片上显示中期染色体数量或结构的变化，也可以在悬液中显示间期染色体DNA的结构。 缺点是不能达到100%杂交，特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。 应用：该技术不但可用于已知基因或序列的染色体定位，而且也可用于未克隆基因或遗传标记及染色体畸变的研究。在基因定性、定量、整合、表达等方面的研究中颇具优势。 FISH – Fluorescent In Situ Hybridization 荧光原位杂交 探针DNA 加入荧光标记 解螺旋，杂交 FISH 16 16 例如左图: 通过使用painting 探针（针对16号染色体)，可以确认16号染色体的一段易位到了9号染色体。 使用Vysis AneuVysion探针组对13, 18, 21, X, Y 染色体进行杂交 普通图像 分类色图像 5号染色体上杂交了7种探针，这些探针在位置上分别有部分重叠。 18 条带 7 条带 原始图像 DAPI图像 实例: X / Y