第三章口 核酸X.ppt

影响DNA复性的主要因素 温度和时间 DNA顺序的复杂性 DNA浓度 DNA的长度及碱基错配程度 温度和时间 保温时间太短以及温差较大均不利于复性，一般认为比Tm低25℃左右的温度是复性的最佳条件，越远离此温度，复性速度就越慢。 复性时温度下降必须是一缓慢过程，若在超过Tm的温度下迅速冷却至低温(如4℃以下)，复性几乎是不可能的，核酸实验中经常以此方式保持DNA的变性(单链)状态。 DNA顺序的复杂性 将温度、溶剂离子强度、核酸片段大小等其它影响因素均予以固定，以不同程度的核酸分子重新缔合的部分(在时间t时的复性率)对Cot（Co为单链DNA的起始浓度，t是以秒为单位的时间）作图，可以得到复性动力学的曲线。 复杂性以非重复核苷酸对的数目表示。如多聚(A)的复杂性为1，重复的(ATGC)n组成的多聚体的复杂性为4，分子长度是105核苷酸对的非重复DNA的复杂性为105。 复杂程度越低，复性速度就越快。 复性动力学曲线 在标准条件下(一般为0.18ml/L阳离子浓度，400核苷酸长的片段)测得的复性率达0.5时的Cot值(称Cot1/2)，与核苷酸对的复杂性成正比，Cot1/2表示复性速度与DNA顺序复杂性的关系。 DNA分子的序列越复杂，Cot1/2越大，复性速度越小。所以，通过Cot1/2值可以推断基因组DNA的杂度。 从复性动力学曲线可以分析到，原核生物的Cot曲线简单，基因组均为非重复顺序，而真核基因组的Cot曲线复杂，基因组中含有许多不同程度的重复序列。 核酸的分子杂交 分子杂交的概念 核酸探针 分子杂交的种类 两种常用的核酸杂交 Southern Blotting Northern Blotting 分子杂交的应用 分子杂交的概念 将不同来源的DNA单链以及DNA单链和RNA依靠同源序列的碱基互补配对，形成双螺旋的方法称为核酸的分子杂交。其产物叫杂交分子 不同来源的，具有大致相同互补碱基顺序的核酸片段称为同源顺序。 一般情况是将热变性后的DNA溶液缓慢冷却，在低于变性温度约25～30℃的条件下保温一段时间（退火），则变性的两条单链DNA可以重新互补而形成原来的双螺旋结构并恢复原有的性质。 核酸杂交可以是DNA-DNA，也可以是DNA-RNA杂交。 核酸探针 用同位素、生物素或荧光染料标记一小段已知序列的多聚核苷酸的末端或全链，称为核酸探针。探针的序列如果与DNA或RNA序列互补，复性时形成杂交分子，就可以探知核酸分子。 分子杂交的种类 核酸的分子杂交技术有很多种： 滤膜杂交、斑点杂交、液相杂交、原为杂交，目前已发展为高通量的芯片杂交技术。 滤膜杂交与斑点杂交 滤膜杂交是指将待测核酸片段结合到滤膜上，然后同标记探针进行杂交。 将粗制的或纯化的核酸样品变性后直接点样于滤膜表面，再与标记的探针进行杂交的方法称斑点印迹杂交或狭缝杂交。斑点印迹为圆形，狭续印迹为线状。 原位杂交 标记探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交的方法称原位杂交。 该法不需要从组织或细胞中提取核酸，而是在组织和细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量的特异性方法之一，在细胞的生物学功能、基因表达调控以至肿瘤发生机制及病原微生物的检测等研究领域发挥着重要作用。 液相杂交 液相杂交是指待测的核酸和标记的探针同时溶于杂交液中进行反应，然后分离杂交双链和未参加反应的标记探针，再进行检测。 由于液相杂交反应条件均一，各种反应参数易确定，反应速度较快，因此便于杂交反应动力学的理论研究。 DNA芯片 DNA芯片是利用微点阵技术，将探针(通常是DNA或cDNA)以高密度点阵的形式按一定的顺序固定排列在1平方厘米的硅片(玻片、尼龙膜等)表面上，再将所研究的样本材料如DNA、RNA或cDNA用荧光标记，在芯片上与探针杂交；然后通过激光共聚焦显微镜等对芯片进行扫描，并配合计算机系统进行分析，从而快速、准确地得出所需信息。 只需要一次实验，DNA芯片便能够将成千上万的基因表达图谱记录下来。 Southern Blotting 用于钓基因，即用已知的DNA单链或RNA，钓取未知DNA分子中的基因，方法如下： 未知的DNA→DNA限制性内切酶→DNA片段→琼脂糖电泳分离→碱液变性→影印在硝酸纤维薄膜上→与放射性标记的已知DNA单链或RNA杂交→放射自显影 Northern Blotting 用已知的DNA钓mRNA，方法如下： 未知RNA→电泳分离→变性→影印→用标记的已知DNA单链杂交→放射自显影 分子杂交的应用 杂交技术是目前研究核酸结构、功能常用手段之一，不仅可用来检验核酸的缺失、插入，还可用来考察不同生物种类在核酸分子中的共同序列和不同序列以确定它们在进化中的关系。例如，一段天