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傻瓜RT-PCR反应体系（Easy-Go? RT-PCR PreMix） 实验方法 据下表将适当浓度的模板RNA和反向引物混合在DEPC处理过的管中。 模板RNA和引物在反应体系中的浓度 反应体系 20μl反应体系 模板RNA 总RNA 0.5-1.0μg Poly(A)RNA 0.05-0.1μg 引物 引物 10-30pmol 2. DEPC处理水补足到20ul。 3. 通过振荡将冻干物完全溶解，然后轻微离心。 4. 加少许矿物油（若使用带加热盖的PCR仪，可省略此步骤）。 5. 根据下列推荐的条件进行cDNA合成。 42℃，60分钟（cDNA合成） 94℃，5分钟（反转录酶失活） 6. 根据PCR反应条件进行PCR反应（退火温度及时间需要针对不同的引物/模板组合加以优化）。 常见问题及参考意见 RNA结构特点及RNase的作用？ RNA是由4种（2’未脱氧的）核苷酸A、U、G、C的单链构成的聚合物。2’-OH对RNA分子的理化性能有重要影响：（1）RNase对RNA的降解作用通过2’-OH进行，不再需要DNase必须的工作金属离子的参与便可完成；（2）RNA分子在强碱条件下，通过2’-OH参与形成2’、3’磷酸二酯（环）自发水解，因此在无RNase的水溶液中其稳定性也远远低于DNA；（3）RNase为较小的单肽链蛋白，尤其是具有较多的二硫键（4对），使得RNase的结构特别紧凑，100℃ 20分钟也不会失活，高压灭菌也不会使之变性。因此，RNA极易受RNase的攻击而降解，导致实验失败。 操作RNA注意事项？ 由于RNA酶的高稳定性、广泛存在性和RNA的不稳定性，在有关RNA操作的实验中须十分小心。 指定特定的区域作为操作RNA专用区，保持实验室低温、清洁的环境，减少空气流动，实验前用RNA酶灭活剂和75%乙醇檫试实验台。 实验过程中需戴口罩及一次性手套，接触可能污染RNA酶的物品后要更换手套。 对于内源RNase的抑制，根据实验特点采取不同方法。如体外转录、合成cDNA第一链等实验，加入RNase的专一抑制剂（RNasin）；对于RNA的分离制备采用非特异的蛋白变性剂，如异硫氰酸胍-巯基乙醇联合变性的方式等。 对于外源RNase，凡不能用高温烘烤的材料如塑料容器等，通常用0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶液37℃浸泡12小时以上，高温灭菌并烘干后使用。DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。所用玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上或180℃烘烤12小时以上，冷却备用。 实验所用试剂也可用DEPC处理，加入DEPC至0.1%浓度，然后剧烈振荡10分钟，再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC，否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。配制的溶液如不能高压灭菌，可用DEPC处理水配制，并尽可能用未曾开封的试剂。注意：DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。 用作RNA分析的电泳槽要用1%SDS清洗，用水冲洗后，然后用无水乙醇清洗，最后用3%双氧水浸泡10分钟。使用前再用DEPC处理水冲洗电泳槽。 cDNA产量很低，为什么？ 可能的原因：（1）RNA模板质量低；（2）对mRNA浓度估计过高；（3）反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足；（4）反应体积过大，一般不应超过50μl。 进行RT-PCR实验时，产生弥散条带，为什么？ （1）在PCR反应体系中第一条链产物的含量过高；（2）引物的用量过高；（3）没有优化PCR反应条件及循环参数；（4）在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时，其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增，一般会显示为弥散背景。 进行RT-PCR实验时，在琼脂糖凝胶分析中看到少量或没有RT-PCR产物，为什么？ 可能原因 建议解决方法 RNA被降解 在变性胶上验证RNA的完整性 使用无污染技术分离RNA 将组织从动物体取出后立即处理 在100%甲酰胺中储存RNA 如果使用胎盘RNase抑制剂，不要加热超过45℃或pH超过8.0，否则抑制剂会稀释所有结合的RNase RNA中包含逆转录抑制剂 通过乙醇沉淀RNA，然后用70%（v/v）乙醇对RNA沉淀进行漂洗。逆转录抑制剂包括：SDS、EDTA、甘油、焦磷酸钠、亚精胺、甲酰胺和胍盐 将对照RNA同样品混合，与对照RNA反应比较产量以检测抑制剂 多糖同RNA共沉淀 使用氯化锂沉淀RNA以除去多糖 用于合成cDNA第一链的Oligo DNA没有很好退火 确定退火温度是否适合您的Oligo DNA。对于随机六聚体，建议在反转录保温之前先在25℃保温10分