植物细胞培养要点.pptVIP

第5章 植物细胞培养与次级代谢产物制备 细胞培养与组织培养的区别 1979年国际组织培养协会专业术语委员会建议： 组织培养：从机体内取出组织或细胞，模拟机体内生理条件，在体外进行培养，使之生存或生长成组织。 细胞培养：动植物细胞在体外条件下的存活或生长，此时细胞不再形成组织。 植物细胞培养的特点 与微生物相比 细胞大（30-100倍） 成团 不耐剪切 生长慢，周期长 易污染（培养基适于微生物生长） 光照影响较大，氧气、二氧化碳含量影响较大。 5.2 植物细胞培养技术 5.2.1 培养基 5.2.2 植物单细胞分离与小规模培养 5.2.2.1 单细胞分离方法 （一）机械法 具体做法： 将叶片轻轻研碎、过滤离心、收集净化 从未分化的疏松易碎的愈伤组织，通过摇床振荡获得分散的单细胞或小细胞团 优点： 细胞不受酶伤害；有利于进行细胞的生理和生化研究。 5.2.2.1 单细胞分离方法 （二）酶解法 酶对细胞壁有一定的软化作用，所以采用酶法时，必须加入甘露醇等渗透压保护剂；可通过加入硫酸葡聚糖钾来提高游离细胞的产量。(纤维素酶，果胶酶) 优点 可获得较多的叶肉游离细胞（但对禾本科植物叶片效果不好）。 5.2.2.1 植物单细胞小规模培养 培养方法 （一）看护培养 （二）饲养层培养 （三）液体浅层静止培养 （四）细胞同步化培养 （五）细胞平板培养 （六）微室培养 （一）看护培养（nurse culture） Muir(1953)首创此法获得烟草单细胞体系。 （二）饲养层培养 （三）液体浅层静止培养 细胞 培养皿 三角瓶 静止 （四）细胞的同步化培养 细胞同步化：同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化是十分困难的。 同一培养体系的植物细胞经常不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞分裂、代谢以及生理生化状态等复杂化。 通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化。 什么措施？ （1）体积选择法 依据：细胞体积大小 方法 常规分选方法是梯度离心 精细的分选可采用流式细胞仪 优点 操作简单 分选细胞维持了自然生长状态，不会有其它处理带来的副作用 缺点 分选精细度较差 （2）低温处理 可以提高培养体系中细胞同步化的程度 Okamura等曾采用此方法使胡萝卜悬浮细胞较好地同步化。 梅兴国等（2001）采用6℃低温处理红豆杉细胞也获得较明显同步化效果。 可能的原因 不同的温度对细胞的有丝分裂有极明显的影响，在一定范围内，温度下降使细胞分裂速度减慢，细胞周期延长，从而相应地延长了分裂期的时间，使分裂指数提高，细胞同步化率升高。 （3）饥饿法 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞 磷和碳饥饿时，获得G1和G2期的同步化细胞。 将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，细胞分裂又可重新恢复。 （4）抑制剂法 通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，使细胞滞留在DNA合成前期，当解除抑制后，即可获得处于同一细胞周期(G1)的同步化细胞。 常用抑制剂主要有5-氟脱氧尿苷(FudR)和羟基尿(HU)。 用羟基尿处理获得同步化细胞的方法在小麦、玉米、西芹等植物细胞培养中已有成功应用。 利用破坏微管的药物将细胞阻断在中期，常用的药物有秋水仙素和秋水仙酰胺，后者毒性较小。 （五）细胞平板培养 (plating culture) 指将一定密度的悬浮细胞接种到一薄层固体培养基中进行培养的技术。Bergman(1960)首创 单细胞的分离：一般采用酶分离法，小细胞团不能超过6个细胞。 单细胞悬浮液的制备：分离的单细胞经培养基洗涤2次以后，调整密度为5×103个/毫升 植板：将1份已调整好密度的单细胞悬浮液与4份35℃的固体培养基充分混合均匀，然后均匀地平铺于培养皿中，其厚度为5mm左右。 细胞平板培养（plating culture) 平板培养的效果一般用植板率来衡量。植板率是能长出细胞团的单细胞在接种单细胞总和中所占的比例。 每个平板形成的细胞团数 植板率＝ 每个平板接种的细胞总数 细胞平板培养 (plating culture) 优点： 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显微镜下对细胞进行定点观察，是单细胞株筛选和突变体筛选的常用方法。 由于它具有筛选效率高、筛选量大、操作简便等优点，被广泛应用于细胞分裂、分化、生理生化、遗传变异、次生代谢产物合成等。 缺点：通气状况不好，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。 （六）微室培养