第五章酵母基因工程要点.ppt

E 酵母菌的表达系统 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 B 酵母菌的宿主系统 C 酵母菌的载体系统 D 酵母菌的转化系统 E 酵母菌的表达系统 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 酵母菌表达系统的选择 多型汉逊酵母也是一种甲基营养菌。其自主复制序列HARS已被 多型汉逊酵母表达系统 克隆，并用于构建克隆表达载体，但与巴斯德毕赤酵母相似，这种载 体在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。所不同的是，HARS质粒 能高频自发地整合在受体的染色体DNA上，甚至可以连续整合100多 目前，包括乙型肝炎表面抗原在内的数种外源蛋白在该系统中获 个拷贝，因此重组多型汉逊酵母的构建也是采取整合的策略。 得成功表达。 由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的急慢性乙型肝炎是一种严重 的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿人成为HBV携带者，其 中相当一部分人可能转化为肝硬化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒 还没有一种有效的治疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒 感染具有重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为其 广泛应用提供了可靠的保证。 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒是一种蛋白包裹型的双链DNA病毒，具有感染力的病毒 乙型肝炎病毒的结构 颗粒呈球面状，直径为42 nm，基因组仅为3.2 kb。病毒颗粒的主要 结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽，它具有糖基化 和非糖基化两种形式。颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、 除此之外，被乙肝病毒感染的人的肝脏还能合成并释放大量的22 病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白。 nm的空壳亚病毒颗粒，其免疫原性是未装配的各种包装蛋白组份的 1000倍。包装蛋白共有三种转膜糖蛋白：S、M、L多肽。 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙型肝炎病毒的结构与性质 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫 传统乙肝疫苗的制备 苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。虽然这种质膜来源的 疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。 第五章 酵母基因工程 C 酵母菌的载体系统 B 酵母菌的宿主系统 A 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 F 利用重组酵母生产乙肝疫苗 D 酵母菌的转化系统 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。 酵母菌表达外源基因的优势 全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS） 酵母菌是最简单的真核模式生物 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 其中酿酒酵母的遗传学和分子生物学研究最为详尽，但巴斯德毕赤酵母 表达外源基因最理想。 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 能导致酿酒酵母中重组蛋白产量提高或质量改善的突变类型 ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型