达安HBV-DNA定量试剂说明书例析.docVIP

1　目的 规范LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA）的检验工作，指导检验人员正确进行乙肝病毒核酸定量的检测，保证检验结果的质量。 2　范围 本规程适用于LightCycler荧光PCR检测仪检测乙型肝炎病毒（HBV-DNA） 3　试剂 中山大学达安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸扩增荧光检测试剂盒 4　仪器 Roche LightCycler荧光PCR检测仪 高速台式冷冻离心机 微量加样器（覆盖1-1000μl） 5　样品处理 样品处理按《PCR实验室标本处理规程》进行收集和处理，具体操作见本规程附录1和附录2。 6　测定 6.1 PCR扩增 6.1.1 打开稳压器电源，再打开计算机电源。 6.1.2 打开扩增仪电源，按仪器操作规程进入扩增循环条件设定。 6.1.3 将循环条件设定为： 程序 循环 温度 保持时间 1 1次 93℃ 2分钟 2 40次 93℃ 5秒 57℃ 45秒 3 1次 40℃ 0秒 6.1.4 检查反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。 6.1.5 将待反应的PCR反应管放入扩增仪中，并根据实际情况和仪器操作规程在程序中定好反应孔位置。 6.1.6 关闭扩增仪盖，按仪器操作规程开始循环。 6.1.7 扩增结束后关闭扩增仪电源，取出PCR反应管，密封放入垃圾桶。 6.2 产物分析 6.2.1 条件设置：反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光数值为F1/F2。点击Quantification读取结果。 6.2.2 基线的确定：取3～8个循环的荧光信号。 6.2.3 噪声容限（阈值）：调节在阴性质控品以上，要求在Step3：Analysis下相关性r值＜-0.97，接近-1.0。 6.2.4 对照标准：保证阴性质控品的Ct值不出现任何数值（默认为40）。 6.2.5 最后记录仪器自动分析计算出的未知标本数值（M），关闭计算机。 结果判断 7.1 如果Ct值＝40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＜1×103。 7.2 如果Ct值＜40，则实验样品的UU DNA含量（基因拷贝数/ml）＝ M 7.3 检测样本中核酸阳性时，按实际结果报告；对可疑结果应复查，需要时与临床联系。 8　注意事项 8.1 各标本沸水浴时间误差不超过1分钟。 8.2 加样时每加完一个要立即盖上封闭好离心管。 9　支持性文件 9.1 《乙型肝炎病毒核酸扩增荧光定量检测试剂盒操作说明书》 8.2 《临床基因扩增检验实验室工作规范》 10　质量记录  附录1：HBV项目标本采集、运送流程图  附录2：HBV样本处理流程图 转置 阳性标准品的稀释及处理： 充分混匀 荧光探针定量PCR技术原理及应用??????PCR技术是通过对基因的选择性片段进行体外高效扩增，实现目的基因的检测。荧光探针定量PCR（FQ-PCR）是一种新的基因定量检测技术，国外文献多用“实时定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美国PE公司商标命名) ”。该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针，巧妙地把核酸扩增（PCR）、杂交及光谱技术结合在一起，从而实现了对目的基因的准确定量检测，正发展成为临床实验诊断的常规技术。 1.原理??????FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，在PCR反应系统中加入一个荧光标记的探针。该探针可与引物包含序列内的DNA模板发生特异性杂交，探针的5’端标以荧光报告基团FAM（6-羧基荧光素，荧光发射峰值在518mm处），靠近3’端标以荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基诺丹明,荧光发射峰值在582nm处)，两者之间构成能量传递结构。当探针保持完整时，5’端荧光报告基团所激发出的荧光信号被3’端淬灭基因吸收或抑制，不出现荧光信号变化。当PCR反应体系中有目的基因存在，就会扩增出特异核酸片段，荧光探针即会根据碱基配对的原理与之杂交。当PCR进入延伸（复制）期，Tap酶从引物3’端开始,随新链延伸沿DNA模板移动，当移动到探针结合的位置时，其5’→ 3’端外切酶活性作用，将探针切断（切口平移效应）。荧光报告基团和淬灭基团间的能量传递结构被破坏，淬灭基团的淬灭作用被解除，荧光报告基团的荧光信号释放出来（图1）。PCR反应每复制一个特异核酸片段，就有一个探针被切断，伴随一个荧光信号的释放。由于被释放的荧光基团数目和PRC产物是一对一的关系，因此用荧光检测技术检测出的荧光信号有无或强弱，即代表扩增产物有无或多少。由于荧光信号是代表扩增产物的有效特异信号，无需进行有效和无效信号分离，实现