小肠上皮细,胞培养.ppt

肠上皮细胞培养技术 报告人：欧阳万金 肠上皮细胞 肠上皮细胞（intestinal epithelial cells,IECS）是具有极性的柱状上皮细胞，参与肠道的消化、吸收、分泌、免疫屏障和应激反应等，黏膜上皮内含有大量的免疫细胞和免疫分子，是机体内最大的免疫组织。 IEC是体内更新最快的一类细胞，对维持肠上皮的功能有重要作用。其快速更新的特性，使其成为研究细胞增殖和分化调控机制、营养素对肠上皮的作用、细胞信号转导、肠道免疫等提供了理想的体外模型。 准备工作 1、对所需用到的器皿的清洗、干燥、消毒 2、培养基和其他试剂的配制、分装及灭菌 3、无菌室或超净台的清洁与消毒 4、培养箱及其他仪器的检查与调试 IEC的培养流程 IEC的培养分为原代培养和传代培养。 分离细胞后立即进行培养称为原代培养，一般将培养的第1代与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养； 存活的原代培养细胞（细胞株）进行传代，称为传代细胞培养。 影响IEC培养的因素 1、材料来源 以取自刚出生且未进奶的新生大鼠最好。 对已进食的新牛大鼠，分离培养过程中使用的培养液、细胞洗涤液(Hanks液)和组织分散液中均应加入2倍浓度的抗生素。 2、消化酶的选择 用0．25％胰酶消化组织，室温下需约1 h，分离得到的大部分为单个细胞，贴壁和生长能力均较差。 胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶I的联合使用，室温消化约40 min即可得到IEC团块，其贴壁能力较强，牛长状态良好，还可减轻对细胞毒性损害，缩短消化作用时间，且肠绒毛细胞团的产率较高。 用嗜热菌蛋白酶作为分离IEC的消化酶，经简便纯化，即可获得较纯的IEC。 3、血清浓度 使用胎牛血清浓度不宜过高，10%-20%胎牛血清常使非肠黏膜上皮细胞增殖。 IEC体外培养所用的胎牛血清的浓度一般不超过5%。 4、IEC的纯度 少量异源细胞的存活对IEC生长繁殖也是重要的，因为IEC与间质细胞存在相互作用关系。 同时应防止其过度繁殖，如降低FCS浓度可减少成纤维细胞和平滑肌细胞增殖。 应用肝素可抑制平滑肌样细胞生长，促进IEC生长增殖。 5、培养基 培养基以新鲜配制为佳，低温(4℃)储存不宜超过1周。 EGF对于促进IEC贴壁十分重要，它与胰岛素合用可促进IEC生长繁殖。 生长基中加入表皮生长因子、胰岛素和谷氨酰胺等更利于原代培养的上皮细胞生长。 6、酸碱度 最适pH因细胞不同及动物种属不同而异。 最适pH有利于细胞本身的酶及其他生长因子发挥较好的效果，从而影响体外培养细胞的生存。 IEC培养最适pH值为7．2～7．4。 IEC的鉴定 用消化酶分离培养的细胞仅凭光学显微镜形态学观察不能鉴定为IEC，尚需其他较为特意的鉴定方法。 1、碱性磷酸酶染色法 影响因素多，阳性率低。 2、电镜法 用电子显微镜扫面观察细胞桥粒和刷状缘是鉴定上皮细胞很有效的方法，但价格昂贵。 3、免疫荧光法 采用特异的抗人上皮细胞膜抗原或角蛋白，特异性强。消化酶从小肠黏膜分离下来的细胞类型主要有IEC、成纤维细胞和平滑肌细胞，成纤维细胞和平滑肌细胞上皮细胞膜抗原或角蛋白呈阴性，故免疫荧光染色检测阳性的细胞可确定为IEC。 * 2012.1.14 胶原酶Ⅳ消化法得到的兔IEC 鸡胚盲肠上皮细胞呈铺石路生长（400×） 幼龄动物小肠 → 单个细胞 → 细胞悬液 → 细胞贴壁生长 → 细胞悬液 → 细胞株或细胞系 剪碎 胰蛋白酶 原代培养 胰蛋白酶 传代培养 IEC的分离方法 机械解离法 酶学解离法 螯合解离法 胰蛋白酶消化法 胶原酶和中性 蛋白酶结合法 胶原酶消化法 嗜热菌蛋白酶法 * * * 根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光(黄绿色或桔红色)，利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。桥粒（ desmosome）是上皮细胞特有的一种细胞间连接结构。桥粒由相邻细胞的细胞膜发生卵圆形致密增厚而共同构成。桥粒为圆形或椭圆形小体，电镜下呈盘状，直径约为 0.2～ 0.5 μ m，厚约 30～ 60 nm。连接区相邻两细胞膜平行 。