小鼠B7-,2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建.doc

小鼠B7-2基因的克隆、测序及其重组质粒的构建 杨建征，金光辉，田梅，潘雪娜，金顺子，刘树铮* （吉林大学卫生部放射生物学重点实验室，吉林 长春 130021） [摘 要] 目的：克隆小鼠B7-2基因编码区的cDNA序列，并构建其表达载体。方法：利用逆转录多 聚酶链反应（RT-PCR）法，以小鼠脾细胞mRNA为模板，扩增获得B7-2基因，与pMD-18T连接作全 自动测序，并利用基因重组技术构建包含B7-2的表达质粒pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr- B7-2。结果：经测序证实获得的B7-2基因与文献报道的基本一致，并成功构建了表达质粒。结论： 成功克隆了B7-2的编码基因，并成功构建了表达载体pcDNA3.1-CMV-B7-2及pcDNA3.1-Egr-B7-2。 [关键词] 共刺激分子B7-2/免疫学；逆转录多聚酶链反应；pcDNA3.1-B7-2表达载体 [中图分类号] Q782; Q785 [文献标识码] A 研究表明,T细胞功能激活是肿瘤免疫基因治疗的关键,而T细胞激活至少需要两种信号：一是T细胞表面的特异性抗原识别受体与抗原提呈细胞上的MHC复合物结合的抗原多肽的相互作用；另一种是抗原提呈细胞上的共刺激分子与T细胞上相应的共刺激分子受体的结合，缺乏共刺激信号，体内的T细胞将不能对肿瘤抗原产生有效的应答而导致免疫耐受 [1]。B7-1（又名为CD80）和B7-2（又名为CD86），。除B细胞来源的肿瘤外，其肿瘤很少表达B7共刺激分子的缺乏肿瘤的弱免疫原性[2,3,4]。本实验从小鼠脾细胞克隆了B7-2基因，并分别把它重组到带有CMV及Egr启动子的pcDNA3.1质粒上，构建成两种真核表达载体，为探讨新的肿瘤基因治疗方案奠定实验基础。 1材料与方法 1.1材料与试剂 昆明系小白鼠，雌性，18g，健康。表达载体pcDNA3.1购自Invitrogen公司，大肠埃希菌DH5α由本室保存。Trizol试剂为Gibco公司产品，全自动测序由TaKaRa公司完成。内切酶、T4 DNA连接酶、T4 DNA聚合酶、RT-PCR Kit均为TaKaRa产品，其它生化试剂均为国产分析纯。 1.2 小鼠脾细胞的制备与总RNA的提取 取健康18g昆明小鼠脾脏，于RPMI1640培养液（无FBS）中用毛玻璃研磨冲洗2次，取2X106脾细胞，用Trizol试剂按试剂盒说明书提取小鼠脾细胞总RNA。 1.3 RT-PCR法扩增 有义链引物：5’-AGAACTTACGGAAGCACCCACG -3’,反义链引物：5’-GCTCTCACTGCCTTCACTCTGC-3’。参照TaKaRa one-step RNA PCR kit 试剂盒说明书，以2μg总RNA为模板进行RT—PCR，循环参数为：50℃ 15min,94℃ 2min,(94℃ 2min,60℃ 30s,72℃ 1min)25个循环，72℃ 10min。 1.4 RT-PCR产物测序 以1%的琼脂糖凝胶电泳，回收930bp大小的基因片段，与pMD18T连接，以ABI公司的自动测序仪对克隆片段进行双向测序分析。 [基金项目] 本课题受国家自然科学基金资助（项目号 [作者简介] 杨建征（1967--），男，吉林省长春市人，在读医学博士，主要从事肿瘤基因放射治疗研究。 * 通讯作者 刘树铮：130021 长春。吉林大学公共卫生学院放射生物教研室。 （E-mail address:drliusz@）3 2 1 Fig.1 Identification of RT-PCR Product 1.DL2000 Marker(upward direction):2000,1000, 750,500,250,100bp;2.RT-PCR product(930bp); 3.Digested by EcoRV 2.2 pMD18T-B7-2测序 测序结果与Gene bank中收录的序列基本一致(有两个碱基不同，但不影响氨基酸编码)，证实本实验成功克隆获得了小鼠B7-2基因的cDNA序列（见图2）。 Fig.2 Sequence analysis of mouse B7-2 cDNA(The 25th and 576th base of the RT-PCR producing sequence are “C” and “G” respectively, different from those( “T” and “A”) of mouse B7-2 cDNA given in Gene Bank, but the “C” and “T” take same roles i