我看到园子,里很多战友求助关于树突状细胞的培养问题.doc

‘我看到园子里很多战友求助关于树突状细胞的培养问题，倾情奉上我培养的方法，对新手朋友也许有所帮助：1. C57Bl/6小鼠2. 处死小鼠，75%酒精浸泡10min3.解剖取出小鼠股骨和胫骨4.取出骨上组织5.冲洗骨髓腔，直至骨变白6.收集的细胞沉淀一10000/ml接种，培养液含200U/mlrmGM-CSF和IL-4  1 隔天换液并补充细胞因子，到第三天的时候如图：可以见到出芽状的突起，突起还不是特别多，也不是很长 第8天的时候，细胞形态已经出来，如图所示： 细胞形态具有典型的树突状细胞形态，长长的突起，到这个时候细胞已经比较成熟了，补充一下：第七天半量换液的时候，加入TNF-a刺激细胞成熟嗯我是根据1999年lutz的方法，当然做了一些改进，培养DC很多人用的是高浓度的细胞，高浓度的因子，但是这样产量不高，我每一次分离一只小鼠的骨髓，大约可以得到10E+7个细胞，分成10盘，每盘10ml培养基，用低浓度的细胞因子，这样可以大大提高产量，每次能培养得到1*10E+7个DC左右，流式细胞术检测：细胞纯度应该大于90%，这个方法还是很好用的。  0 一张图片发不完，只能再加一个  0 分离的时候注意严格无菌操作，骨头取出来，去除了骨上组织之后，在75%无水酒精里面浸泡2分钟，然后用1640清洗4次，再冲洗骨髓，不容易被污染2. How many cell will you get genreally from one mouse?培养之前细胞数大约是10的7次方左右(杂的细胞），培养之后1*10的7次方，文献报道的是10的8次方，我做得最好的时候也没有那么多，保守一点1000 rpm 8min 的离心是不会对细胞造成任何伤害的，至少我做的时候没有见到细胞因为离心死去DC前体细胞是贴壁生长的，但是在成熟过程中，细胞是悬浮生长的，不会贴壁，收集的时候收集细胞培养液离心收集2. 200U/mlrmGM-CSF和IL-4 —— 是指两种因子分别是 200U/ml ？ 是的，两种因子的终浓度都是200U/ml3. 第七天半量换液的时候，加入TNF-a刺激细胞成熟 —— TNF 浓度是多少，为什么加 TNF ？TNF-α一方面抑制粒细胞的产生,另一方面促进DC的成熟,使其具有很强的刺激T淋巴细胞的活性。因为我做的是要DC体外激活淋巴细胞所以加了TNF，TNF-a我加的终浓度是1000U/ml，刺激18小时候就收集细胞照片是在收集细胞于6孔板的时候照的，培养DC的时候肯定是有一些贴壁细胞的，不影响，而且中间还可能混有一些淋巴细胞，只是在没有IL-2存在的情况下，淋巴细胞生存不了多久，拍照片是在收集之后，没有收集的时候细胞没有这么密，背景也有贴壁细胞，只是在GM-CSF浓度低（200U/ml）的情况下，相对于高浓度（1000-2000U/ml）来说贴壁的细胞少得多，这个是什么原因，我也不太清楚，也没有查文献考证，只是主观地认为那可能是一些巨噬细胞，希望你实验顺利！活性单位是个效应单位，是表示生物制品的活性的，和质量单位不是简单换算关系。有生物活性的物质，往往可杀死生物（如抗生素可杀死细菌）或促进生物增殖作用（多数细胞因子可促进细胞增殖）。在活性检测时，设定一个浓度剃度，测得最小致死量（如：抗生素）或最大有效量也称饱和有效量（如：某些细胞因子）的浓度，然后取中位数（即半数致死量或半数有效量）的倒数就是活性单位。如：RD的说明书注明GM-CSF的Activity（活性）：ED50 =10 - 60 pg/mL(ED50，ED是最大有效量，50表示50％，ED50就是半数最大有效量）。你取其倒数，就可算出它的活性单位了，因此，它活性远超1U/ng。生物制品的活性不是固定不变的，不同的公司、不同的批次，其活性都不同，其中RD的细胞因子活性是比较好的，也是比较稳定的。我公司自主研发的rmGM-CSF的活性也相当不错，可和RD的媲美，远好于peprotech的rmGM-CSF，而且价格只有RD的1/4，因此，得到国内众多研究机构的喜爱到RD公司的网站上会有换算的方法，就是1ug=XXX WHO U如果实在找不到的话悄悄话发你的邮箱，我会发给你的我知道cj兄的因子，上次我请示老板说你们的因子也很好，想买，老板表示否定，我也不能做主，所以非常抱歉啊！我们是GM-CSF是我公司（杭州隆基生物技术有限公司）自己研发。目前，在过来已有40多家科研单位长期订购，反应还是非常好。我接触的不少网友，他们都说自己已经养出DC，只是数量少、纯度低，而当他们提供照片时，就发现绝大多数网友其实并没有养出一个DC，而仅仅是几个为数不多的杂细胞。他们的普遍特点是没有集落形成。不知你培养的DC集落多吗？如果没有典型的密集而硕