第03章 细胞生物学的研究方法幻灯片.pptVIP

第二节 生物化学分析技术 细胞系和细胞株 原代培养细胞（primary culture cell） 传代培养细胞（sub-culture cell） 细胞株（cell strain） 正常二倍体，接触抑制 细胞系（cell line） 染色体改变，接触抑制丧失 群体培养：将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层； 克隆培养：将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，此种集落即称为克隆(clone)。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 此外，为了制取细胞产品而设计了规模培养法，如转鼓培养法、发酵罐培养。 细胞培养方式大致可分为两种： 第四节 其它实验性操作技术 针对不同种类的细胞，学者们设计出了许多细胞培养基配方，目前使用比较广泛的化学合成培养基(chemically defined medium)有TC-199、MEM、L-15和RPMI-1640等。 但是在工作中要针对不同的培养对象来选择最适培养基，培养基选择恰当与否是细胞培养是否成功的关键。 第四节 其它实验性操作技术 ①细胞所需要的营养成分要尽量予以满足； ②要保持适当的渗透压； ③严格控制pH； ④添加细胞所需的生长因子。 为了满足细胞生长所需的一些营养条件，常在培养液中加入适量的血清。然而血清的来源有限，而且血清的成份复杂，影响实验结果的分析，因而近来研究出无血清培养技术。 第四节 其它实验性操作技术 在细胞培养工作中，有几种因素需要特别关注： 正常组织的初级培养物，细胞传代培养均有一定的限度，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。 所谓转化(transformation)即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。如HeLa细胞系（1951年从Henrietta Lacks的宫颈癌细胞培养而成）。 迄今我国业已建立了上百个细胞系，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。 通过细胞培养，世界上已建立了大量细胞株或细胞系。 第四节 其它实验性操作技术 被离心的物质所受的离心力不仅与转速有关，而且还同物质到转头中心的距离有关。因此要准确表示离心条件要用离心力，而不单是转速。 离心力(g)是由角速度和旋转半径(R)的大小决定的，单位为克，计算公式如下: g = ω2·R (2?n)2 3600?980 ?R g = 第二节 生物化学分析技术 各种颗粒在离心场中的沉降速度不同，这取决颗粒的大小、形状和密度，也与离心力以及悬液介质的密度和粘度有关。 式中S为沉降系数(秒)；R为沉降颗粒到转头中心的距离(半径，cm)；ω为角速度，以每秒转动的弧度表示；t为时间(秒)。 当颗粒受到的净离心力（离心力与浮力之差）与溶剂的摩擦阻力达到平衡时，单位离离心场强度的沉降速度为定值，此即为沉降系数(sedimentation coefficient, S)。 第二节 生物化学分析技术 根据分离的对象和目的不同，超离心技术可分为两大类： 用于制备和纯化亚细胞成分和大分子，目的是制备样品 分析和测定制剂中大分子的种类和性质(浮力密度和分子量等) 制备离心 (preparative cetrifugation) 分析离心 (analytical centrifugation) ? ? 第二节 生物化学分析技术 利用肝脏制备各种亚细胞组分的制备离心过程示意图 匀浆物 肝脏 上清夜 完整 细胞 完整 细胞 1000g 20min 核 线粒体 溶酶体 过氧化物酶体 微粒体 内质网 100000g 120min 105000g 20min DNase 静置20min 10000g 20min 核糖体 第二节 生物化学分析技术 差速离心 密度梯度离心 CsCl密度 梯度离心 蔗糖密度 梯度离心 第二节 生物化学分析技术 低速离心 中速离心 高速离心 超高速离心 细胞匀浆 细胞 核仁 细胞骨架 大细胞器 小细胞器 核糖体 大分子 离心 样品 蔗糖的稳定梯度 慢速沉降成分 快速沉降成分 分画 样品 蔗糖的不连续梯度 低浮力密度成分 高浮力密度成分 流式细胞分选术 (fluorescence-associated cell sorting, FACS) 激光 细胞悬液 鞘液 液滴加电信号 探测器 超声波振摇器 加负电的液滴 加正电的液滴 细胞收集容器 细胞收集容器 废液容器（未探测细胞） 第二节 生物化学分析技术 核酸杂交原理示意图 第二节 生物化学分析技术 六、分子杂交技术 原理：具有互