5苛养菌的分离与鉴定课稿.ppt

苛养菌的分离和鉴定 卫生部北京医院检验科 陈东科 概 述 苛养菌(fastidious microorganism)是一类生长需要特殊营养物质的细菌，与许多感染性疾病有关，其分离培养较为困难，由这些菌引起的感染发病率一直难以估计。因此，对苛养菌的分离鉴定和药敏试验不仅是临床迫切的需要，同时也是衡量一个细菌室技术水平的重要标志。 临床上常见的可养菌 肺炎链球菌； 卡他莫拉菌（非严格的苛养菌）； “HACEK”细菌群 H代表嗜血杆菌属(Haemophilus) A代表放线杆菌属(Actinobacillus) C代表心杆菌属(Cardiobacterium) E代表艾肯菌属(Eikenella) K代表金氏菌属(Kingella) 4. 其它苛养性细菌：如淋球菌、脑膜炎球菌、军团菌、巴斯德氏菌、布氏杆菌、鲍特氏菌、念珠链杆菌、碳酸噬胞菌等。 一、肺炎链球菌的分离和鉴定 肺炎链球菌（S.pneumoniae），俗称肺炎球菌（pneumococcus）。经常寄居于正常人的鼻咽腔中，一般不致病，只形成带菌状态。当机体免疫力下降时才致病。尤其在呼吸道病毒感染后或婴幼儿、老年体弱者易发生肺炎链球菌性肺部感染。 肺炎链球菌很少产生外毒素，主要靠荚膜侵袭力致病。肺炎链球菌主要引起人类大叶性肺炎，肺炎后可继发胸膜炎、脓胸，也可引起中耳炎、乳突炎、副鼻窦炎、支气管炎、心内膜炎、腹膜炎、关节炎、脑膜炎和败血症等。 细菌学检验不仅对疾病的病原学诊断有重要价值，同时对临床治疗的药物选择也具有十分重要意义。 （一）生物学性状 1. 形态与染色 肺炎链球菌革兰染色呈阳性。球形或矛头状，成双排列，少呈链状。在组织中可形成荚膜（人工培养荚膜逐渐消失），无鞭毛及芽孢。 2. 培养特点 （1） 培养基 肺炎链球菌对营养要求较高，需采用质量好的哥伦比亚琼脂基础和新鲜血液（ 5％马血或羊血） 。 琼脂浓度可适当下降至1％～1.2％，有利于肺炎链球菌的生长。 （2）分离培养 1）标本处理 及时将采集标本接种到适当的培养基上是提高分离率的前提。因为，肺炎链球菌对干燥、对寒冷的抵抗力均较弱，在标本离开机体暴露于外界复杂的环境中，其存活率十分低，不及时接种适当培养基是导致分离率低的主要原因。 2）选择性分离培养基 培养基中添加5μg/ml庆大霉素有利于肺炎链球菌的分离。 3） 培养环境 5～10％CO2、35℃培养24～48h。 （3）肺炎链球菌的菌落形态 在营养丰富的培养基上，肺炎链球菌形成扁平、中间有凹陷的典型菌落，少数菌可呈粘液型菌落。 3.抗原结构 （1）种属特异性抗原：为菌体多糖抗原，存在于肺炎链球菌的细胞壁。 （2）型特异性抗原：是存在于肺炎链球菌荚膜中的一种多糖多聚体，可溶于水，据此抗原可将肺炎链球菌分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……等个型，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型致病性最强。 （3）菌体核蛋白抗原：存在于菌体深部，为蛋白质，无特异性。 （二）肺炎链球菌鉴定 肺炎链球菌的鉴定，主要应与甲型溶血性链球菌鉴别。其中以胆汁溶菌试验、菊糖发酵和optochin试验最为常用。必要时可作小鼠毒力试验加以鉴别。在上述试验中，肺炎链球菌均应阳性，而甲型溶血性链球菌为阴性。必要时可用特异性单克隆乳胶或自动化仪器等相应鉴定卡作鉴定。 肺 炎 链 球 菌 鉴 定 要 点 革 兰 阳 性 双 球 菌， 矛 头 状， 不 呈 链； 血 平 皿 菌 落 呈 草 绿 溶 血， 湿 润， 菌 落 表 面 无 小 白 点； 培 养 时 间 长 出 现 脐 窝 状； 胆汁溶解试验阳性； 乳 胶 单 克 隆 抗 体 凝 集 阳 性。 1. 溶血性检查 肺炎链球菌在厌氧或二氧化碳环境中溶血能力大大加强，草绿色溶血环很大，可与其他草绿色链球菌相区别。 2. Optochin(OP)敏感试验 optochin即乙基氢化叩卟啉，因结构似于奎宁，故又称为乙基氢化羟基奎宁。该药对肺炎链球菌的作用机制是干扰其叶酸的合成。 optochin敏感试验方法似药敏试验。挑取被检菌，密涂于血平板上，贴上含5μg/片的optochin纸片，置5~10%CO2的大气中（或烛缸），35℃孵育过夜。抑菌环直径=14mm为敏感，推断为肺炎链球菌。抑菌环直径14mm时参照胆汁溶菌试验。肺炎链球菌的抑制圈直径常在20mm以上，甲型溶血性链球菌（约98%）小于12mm。 也有例外，我们在实际工作中检出过耐optochin的肺炎链球菌，并发现大多数的缓症链球菌和部分口腔链球菌对op