血清蛋白电泳醋纤电泳、圆盘电泳1__培训课件.ppt

（3）凝胶溶液加毕后，随即吸取蒸馏水，加至管中的凝胶表面，使其表面覆盖一水层（水封，1.0cm 高）。在灌胶和封水的过程中，操作要轻，以避免产生气泡。 （4）将加注好的凝胶管于室温下静置，以进行聚合反应，在正常情况下大约30-60分钟后，待界面出现明显分层现象时，表明胶已聚合完毕，先用习惯吸去上面的水层，在用滤纸将残留的水分吸干。 2.样品液制备 取正常人血清0.1ml，与1.9ml的上样缓冲液混合 3.装柱 将凝胶管插入电泳槽槽底橡胶塞孔中，加入电极缓冲液与下电泳槽，随后放入凝胶管及上槽，除气泡(上电极槽以电极和凝胶管完全浸入为宜，下电极槽以凝胶管浸入3/5为宜)。用微量注射器吸去混合后的样品液30μl加到分离胶面上（加样枪不可插入过深，以免刺破凝胶，同时要缓慢、均匀，以免搅动缓冲液引起样品扩散），最后加入电泳缓冲液。 4.电泳 接通电源，上负下正，调节电流3mA/管，电压260V-280V，待示踪染料离管下口0.5cm时切断电源。 5.剥胶 注入蒸馏水做润滑剂，针头螺旋式前进，缓缓剥离，最后用洗耳球在管的一端轻轻挤压，另一端对着一干净大小适宜的培养皿内，此时可以将凝胶柱压出玻管。 6.固定和染色 用固定液浸泡凝胶条，此过程用来固定蛋白质，10min后倒去固定液，再加入染色液，在90℃水浴染色15min，倒去染色液。 7.脱色 将染色完毕的胶条用脱色液浸泡，中间更换1~2次脱色液并浸泡过夜，将浮色脱去进行观察染好色的蛋白带 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺是神经毒性试剂，可经皮肤、呼吸道等吸收，对皮肤有刺激作用，注意避免直接接触 ，故操作时要注意保护 没有聚合的丙烯酰胺不要倾倒到水源附近，实验中全部的胶统一放到指定的容器中，由专门的人收集到一起，统一处理。 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺溶液应装在棕色瓶中，用前检测pH值是否失效。失效液不能聚合。 加速剂（TEMED）要密封保存，过硫酸溶液现配现用，防止氧化失效。 配好胶后应尽快灌胶（不要形成气泡） 切记装柱后应用蒸馏水密封 灌胶和电泳时要注意排气泡 加样时不能损伤凝胶表面 电泳时凝胶管不能漏水，并且与电泳池垂直 固体胶切忌倒入水池 注意事项 THANK YOU 实验二 血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳 带电粒子在电场中移动的现象称为电泳。 电泳技术即是利用样品中各种带电粒子的带电性质、分子大小、形状等的差异，在电场中的迁移速度不同，从而对样品分子进行分离、鉴定、纯化和制备。 在生物医学领域，该技术多用于分离，纯化、鉴定蛋白质、核酸等大分子物质。 一、电泳技术 电泳速度:带电粒子在电场中运动时，单位电场强度内粒子运动的速度，以u表示，即 V—粒子运动的速度 X—电场强度 Q—粒子所带电荷 r—粒子的半径 η—介质的粘度 影响电泳速度的因素 1、影响电泳迁移率的外界因素： 电场强度 溶液的pH值 溶液的离子强度 电渗现象 2.影响电泳迁移率的内在因素： 样品所带净电荷的量 样品的大小和形状 掌握电泳法分离血清蛋白质的原理 掌握血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳的操作方法及临床意义 二、实验目的 本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。 方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。 由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。 三、实验原理 经醋酸纤维素薄膜电泳可将血清蛋白按电泳速度分为5条区带，从正极端依次为清蛋白、α1球蛋白、α2球蛋白、β球蛋白及γ球蛋白，经染色可计算出各蛋白质的百分含量。 γ β α2 α1 清蛋白 蛋白质名称 等电点 相对分子质量 白蛋白 4.88 69000 α1-球蛋白 5.06 200000 α2-球蛋白 5.06 300000 β-球蛋白 5.12 90000~150000 γ-球蛋白 6.85~7.50 156000~300000 人血清蛋白质的等电点及分子量 1.实验材料：未溶血的人血清 2.实验试剂： 巴比妥缓冲液 氨基黑10B0.5％染色液 漂洗液 透明液 3.实验器材： 醋酸纤维薄膜（2×8cm） 常压电泳仪 镊子 点样器 玻棒 粗滤纸