第二章 物细胞的获取.ppt

第二章　植物细胞的获取 南昌大学生命科学学院 罗丽萍　 第一节　外植体的选择与预处理 成功关键：培养基及培养条件、外植体的来源。 一、外植体的选择 从生长正常，无病虫害的母株中，选择适宜的组织器官 1、用于直接分离细胞的外植体的选择 原则：细胞之间粘连程度较小； 叶片最佳； 限制：机械或酶伤害细胞，完整细胞较少。 2、用于愈伤组织诱导的外植体的选择 双子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、下胚轴、子叶、叶片、根等。 单子叶植物中常用的外植体有：幼胚、成熟胚、细穗、花药等。 无论是双子叶植物还是单子叶植物、均以幼胚诱导愈伤组织的为最佳。因为幼胚诱导的愈伤组织质量最好，分化能力强。 基因型的影响：不同种类及不同品种之间存在差异； 同一植物，不同部位脱分化和再分化能力存在差异：百合：外层＞内层；紫草根＞茎叶；苹果顶芽褐变程度＜侧芽；兰科：茎尖； 还要考虑生产目的：选用植株中主要生产所需的的次级代谢产物的组织和器官 2、用于愈伤组织诱导的外植体的选择 外植体的生理状态：红豆杉：新生的嫩枝； 取材季节：母株生长旺盛的季节；紫草：秋天（紫草宁合成和积累）； 外植体大小：适当大小；脱毒率和茎尖大小及成活率之间的关系； 3、用于分离原生质体的外植体的选择 分离原生质体则以叶片为最好。苗龄与叶龄有关；太老不易游离，太嫩，易游离，但细胞膜易损害； 以苗龄15－25d，刚展开的幼叶为最佳。 无菌苗幼叶； 还要考虑培养目的； 多数情况下，需要根据实验确定； 4、花粉材料的选择 用作花粉培养的亲本植株的基因型、生长情况以及接种时花粉所处的发育时期，对花粉植株的诱导频率都有直接的影响。 关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。 大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核期，或单核中晚期。 四分体－－小孢子－－单核花粉－－双核花粉 1、外植体的灭菌处理常用表面灭菌剂使用浓度及效果比较表 几种常用消毒剂的效果比较 外植体表面灭菌过程： 选材 刷洗、冲洗 用洗衣粉水或肥皂水浸洗并搅动 　自来水冲净洗衣粉水 70％酒精浸泡10～30秒振荡 0.1％升汞3～10分钟(表面活性剂) 无菌水冲先3～5次　　　 　　　　　接种 2、外植体的其他处理 目的：提高愈伤组织诱导率；促进原生质体游离。 方法： 预培养； 暗处理； 低温或高温处理； 萎蔫处理； 抗氧化剂处理； 高渗透压预处理； 花药和花粉培养的预处理： 最常用的方法是低温冷藏。具体做法是将带有叶鞘的穗子或花蕾用湿纱布包裹后再用塑料袋套起，放在冰箱中冷藏。 不同材料对处理温度的高低有不同的要求，一般耐寒植物比喜温可耐受较低的温度。低温处理时间视使用的温度而定，较低的温度处理时间要短，反之则长。烟草7～9度下处理7～14天，水稻7～10度下处理10～15天，大麦3～7度下处理7～14天，都可显著提高花药的出愈率。 低温处理的作用： 预处理引起花药、花粉内源激素发生变化，改变了小孢子（花粉粒）第一次有丝分裂的轴向发育（正常发育时，两次有丝分裂形成三核花粉粒），产生两个相等核，进而形成愈伤组织或胚状体。 保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老。 激发花粉产生原胚。 促使细胞同步分裂。 第二节　从外植体直接分离植物细胞 一、机械捣碎法 将外植体捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞。 优点：不用酶，细胞不会受到伤害；没有经过质壁分离，利于生理生化研究。 缺点：机械作用，细胞结构破坏大，得率低。 最佳材料：叶片 方法及步骤： 第一种方法：用刀片刮叶片 第二种方法：先把叶片轻轻研碎，然后通过过滤和离心净化细胞。 叶片表面灭菌→切成小于1cm2的小块→玻璃匀浆管中匀浆→过滤（孔径分别为：61?m和38?m）→低速离心，弃上清→悬浮细胞→细胞培养 二、酶解法 利用果胶酶、纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞；该法不仅能降解中胶层，而且还能软化细胞壁。所以在用酶解法分解细胞的时候，必须对细胞给予渗透压保护。常用的渗透压保护剂是甘露醇。 首次成功：烟草叶细胞 步骤：叶片表面灭菌→撕去下表皮→切成4cm2小块→放入酶液中→抽真空→摇床上酶解→每30min更换一次酶液（第一次弃去，第二次主要含海绵细胞，第三、四次主要含栅栏细胞）→收集细胞，培养基洗二次后培养 机械法和酶解法比较 机械法：细胞不受到酶的伤害；不用质壁分离，有利于进行生理和生化研究 ；容易伤害细胞结构，获得完整细胞团或细胞数量极低；细胞易破。 酶解法：细胞受到酶的伤害；要质壁分离；细胞产量高；细胞不易破。 第三节　通过愈伤组织诱导获取植物细胞 一、获取过程： （1）诱导产生愈伤组织； （2）愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性