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生物化学-酵母提取参考资料
综合实验 酵母RNA的提纯及其定性鉴定与定量测定
一、实验目的
1、学习RNA提取的几种常用方法并掌握浓盐法提取RNA的原理和方法。
3、掌握几种定性鉴定所得RNA的原理与方法。
4、掌握两种定量测定所得RNA的原理和方法。
5、学习电泳技术的基本原理及其分类以及相关的应用。
Ⅰ 提纯部分
浓盐法提取酵母RNA
Ⅱ 定性鉴定部分
一、RNA基团鉴定
二、电泳分离鉴定
三、光谱鉴定
四、纯度鉴定
Ⅲ 定量测定部分
一、地衣酚法定量测定
二、紫外吸收法定量测定
生物大分子物质提取的基本原理与步骤
一、材料选择与处理
二、细胞破碎
三、细胞器分离
四、提取
五、纯化
六、浓缩、干燥
七、样品保存
八、定性鉴定
九、定量测定
10、物质的利用
核酸的分布
DNA:细胞核(95%)
细胞器(5%)
RNA:细胞质(75%)
细胞核(10%)
细胞器(15%)
RNA以rRNA的数量最多(80%-85%)
核酸提取的主要步骤
破碎细胞
去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子
去除其它不需要的核酸分子
沉淀核酸,去除盐类,有机溶剂等杂质
核酸分离纯化原则
保证核酸一级结构的完整性
排除其它分子的污染
简化操作,缩短时间,以减少各种有害因素对核酸的破坏
减少化学因素对核酸的降解(pH4-10)
减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力 、 高温)
防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶)实验原理
由于RNA的来源和种类很多,因而提取制备方法也各异,一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是实验室最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后,RNA即溶于上层被苯酚饱和的水相中,DNA和蛋白质则留在苯酚层中,向水层加入乙醇后,RNA即以白色絮状沉淀析出。此法能较好地除去DNA和蛋白质,提取的RNA具有生物活性。
酵母细胞富含核酸,且核酸主要是RNA,含量为干菌体的2.67%-10.0%,而DNA含量较少,仅为0.03%-0.516%。为此提取RNA多以酵母为原料。工业上制备RNA多选用低成本、适于大规模操作的稀碱法或浓盐法。这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA,主要用作制备单核苷酸的原料,其工艺比较简单。
稀碱法是用氢氧化钠使酵母细胞壁变性、裂解,然后用酸中和,除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。
浓盐法是用高浓度盐溶液处理,同时加热,以改变细胞壁的通透性,使核酸从细胞内释放出来。
RNA提取方法方法与分类
稀碱法( 0.2% NaOH )
浓盐法( 10% NaCl )
苯酚法
氯仿-异戊醇法
去污剂法
盐酸胍法
三、试剂和器材1、试剂
(1)干酵母粉
(2) RNA标准溶液(100微克/毫升)
(8) 5%硝酸银溶液
(9)钼酸铵试剂2克钼酸铵溶解在100毫升10% 硫酸中。
(10)地衣酚试剂:100毫升浓盐酸加入100毫克三氯化铁,摇匀,贮存备用,使用前加入100毫克地衣酚。
(11) NaCl
(12) 95%乙醇
(13) 6 mol/l HCl
(14)高氯酸
(15)氯化锂
(16)硼酸缓冲液(pH-3.5)
(17)磷酸缓冲液(pH-7.5)
2、器材(1)电子天平 (2)电热套 (3)三角烧瓶 (4)烧杯 (5)高速冷冻离心机 (6)滴管(7)抽滤瓶 (8)离心管 (9)恒温水浴箱(10)吸量管 (11)紫外分光光度计 (12)表面皿 (13)量筒 (14)容量瓶 (15)擦镜纸 (16)比色皿 (17)玻棒 (18)定量滤纸 (19)试管 (20)布氏漏斗 (21)真空泵 (22)电泳仪
(23)紫外检测仪(24)可见光分光光度计
(25)托盘天平 (26)电泳槽 (27)0.5-5.0精密pH试纸
四、实验方法RNA的提取的操作3、 RNA提取方法(浓盐法)
①取 13g活性干酵母,置250 ml烧杯中,加入120 ml蒸 馏水,混匀;
②倒入8 g NaCl,电热套加热45分钟(玻棒要不断触底搅拌) ;
③稍微冷,3500 rpm离心8 min,将上清倒入50 ml烧杯 中。
④ 将烧杯冰浴10 min
⑤用HCl小心调节pH,至2.0~2.5;⑥将烧杯冰浴10 min;
⑦将烧杯中物质(含沉淀)移入10 ml离心管中, 3500 rpm离心8 min,弃上清,
⑧将沉淀转移到1.5ml小离心管中,9
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