ISH rotocol 荧光原位杂交技术 实验方案.docVIP

地高辛标记寡核苷酸，荧光标记二抗，ISH，冰冻切片操作过程： 多甲固定：应尽量在半个小时内完成。（固定时间以24-36小时为宜，避免RNA降解或固定过度。） 切片:为获得高杂交信号，冰冻切片应切成10um-20um。（选用16um）（切好的片子可以保存在-70度中）但是要注意，保存在-70度中的切片，拿出来以后，立即在4%的多甲中重新固定，避免在重新固定前切片恢复室温。（重新固定10-15min） 用0.1MPB洗切片3*5min 切片放入100%乙醇5min，空气中干燥。 杂交液：（20ml） 藏于-20度 20*SSC 4ml 硫酸葡聚糖 4g 去离子甲酰胺 10ml 将他们溶解后，加入以下物质： Poly A（10mg/ml） 0.5 ml SsDNA（10mg/ml） 0.5 ml tRNA （10mg/ml） 0.5 ml DTT (1M) 2ml 50*Denhardts 0.2ml 上述溶液可以配置后长期贮藏与-20度中，用前预热到37度。 杂交溶液：将地高辛加入杂交液中，探针的浓度需要摸索（一般是100ng-1000ng/ml，一般是以200ng/ml为起点来摸索条件），所加的杂交液的体积看切片的大小来决定，对于2cm*2cm的组织，一般是加50ul，但是对于嗅球，可能30-40ul足够。 加好杂交液以后，用盖玻片盖上切片（注意中间不要留有任何的气泡），为防止杂交液从盖玻片中流走，注意使切片保持水平，并且注意切片不能干燥，（干燥的话杂交会有一个很高的背景） 在湿盒中37度杂交18小时，这个杂交时间可以延长到40小时来提高杂交的信号，但是前提是不能让切片干燥。 杂交后处理; 制备0.5*SSC和1*SSC（从20*来稀释）并且保证这两种SSC在使用的时候的温度是55度。 注意配置0.5*SSC和1*SSC中含有10mM的DTT（将1.2g的DTT加入到800ml的SSC中） 杂交后，用小镊子将盖玻片轻轻移走，然后倒掉杂交液，将切片放入洗液中，在振摇水浴 中按照下面的要求来洗片： 快洗： 1*SSC（10mMDTT）室温 2*15min：1*SSC（10mMDTT）55度 2*15min 0.5*SSC(10mMDTT) 55度 1*10min 0.5*SSC（10mMDTT）室温 将切片一直放在最后一步的溶液中一直到下一步操作。 检测： 将切片转移到TBS缓冲液中（100mM tris-HCl，150mM NaCl，PH=7.5），将切片在TBS缓冲液中洗3*5min， 封闭：（可选） 将切片放在封闭液中放置30min（封闭液配方:TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche））, 将切片拿出封闭液中，用地高辛抗体和切片在TBS+0.1%triton X-100+1%正常绵羊血清（sigma）或者是1%的其它合适的封闭剂（Roche）于室温下孵育至少4小时，然后在TBS中洗3*5min ，然后在去离子水洗涤几次以去除盐，最后用抗淬灭剂分片观察 原位杂交要做的对照; 切片中mRNA的质量（前提是新鲜的组织样品）和protocol的有效性。 PolyT探针：如果PolyT探针杂交的信号很弱的话，说明切片的RNA已经降解比较严重。 杂交特异性对照：①检测探针只是和RNA结合，用RNA酶处理后如果没有杂交信号的，则说明杂交只是和RNA结合。（注意，RNA酶的处理应该在固定以后用PBS洗两次*5min立即进行） 用正义和反义探针来杂交，如果用正义探针杂交得不到任何的信号，则可以说明杂交的信号是特异性的 杂交预处理： 在37℃ 恒温箱内干燥切片后，滴加 5-10μg/ml蛋白酶K，置37℃ 湿盒内孵育30min， 4℃75％ 酒精漂洗5min中止蛋白酶K活性。 一般应用蛋白酶K 1μg/ml(于0.1 mol/L Tris,50 mmol/L EDTA,pH8.0缓冲液中)，37℃孵育15~20 min，以达到充分的蛋白消化作用而不致影响组织的形态为目的。蛋白酶K还具有消化包围着靶DNA的蛋白质的作用，从而提高杂交信号。甘氨酸是蛋白酶K的抑制剂，常用0.1 mol/L的甘氨酸溶液(在PBS中)清洗以终止蛋白酶K的消化作用，应用胃蛋白酶(Pepsin)20~100 μg/ml(用0.1 N HCl配)37℃、30 min进行消化，所获实验结果优于蛋白酶K。为保持组织结构，通常用4%多聚甲醛再固定。 2、0.25% 醋酸酐10min, 经70℃ 2×SSC漂洗、40℃ 2×SSC各漂洗15min，2×SSC 3min，切片经75-100% 酒精