精选课件第四章酶的分离纯化.ppt

第三章 酶的分离纯化与保存 酶的分离纯化是酶学研究的重要环节之一。 针对化学本质是蛋白质的酶而言，其分离纯化的方法主要沿用蛋白质分离提纯的方法。 酶的分离纯化又有其自身特点： 难点：目标酶在细胞中含量少 优势：可通过测定酶活性的方法进行示踪 酶的分离纯化是一门实验科学 酶的分离纯化，就是将酶从细胞或者其他含酶的原料中释放出来，再与杂质分开，而获得符合研究和使用要求的酶制品的过程 胞内酶：在细胞中，酶在核糖体上合成后，即转运到各个作用部位，并不断补充和更新 胞外酶：合成后穿过质膜，定域到质膜外表面、周质空间、外膜及细胞外环境中的酶 不同的酶分离纯化的方法不同：胞内产物需经细胞破碎，细胞碎片分离等步骤；胞外产物则将细胞去除后，对余下的液体即可进行初步纯化 选用技术前，需考虑： 1.目标酶分子特性及其他物理、化学性质 2.酶分子和杂质的主要性质差异 3.酶的使用目的和要求 4.技术实施的难易程度 5.分离成本的高低 6.是否造成环境污染 主要过程： 细胞破碎 ? 酶的提取 ? 离心分离 ? 过滤? 沉淀? 层析? 电泳? 萃取?浓缩?干燥? 结晶? 保存。。。 一、酶分子制备的前处理 1、生物材料的选择 选择目的酶含量高的 选择容易取材的 利用细胞培养技术和基因工程重组DNA技术。 目前，酶的来源大都为来自微生物 材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存，且动物材料则需深度冷冻保存： 动物组织要先除去结缔组织、脂肪等，绞碎后在适当的溶剂中提取。如果所要求的成分在细胞内，则要先破碎细胞。 植物要先去壳、除脂。 微生物材料要及时将菌体与发酵液分开。 2、 细胞的破碎 将细胞和组织破碎，使酶分子（胞内酶）充分释放到溶液中，并不丢失生物活性。 不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同 如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。 机械法（注意预冷）： 捣碎法：10000rpm 研磨法： 匀浆法：研杆和管壁间只有几百微米 物理法： 反复冻融法：时间长，需加蛋白酶抑制剂（PMSF、EDTA等） 超声波处理法：处理时间尽量短，避免局部过热使得酶失活 渗透压法： 冷热交替法： 化学与生物化学方法 自溶法：利用细胞自身酶系，保持一定pH和温度条件，使细胞破坏 有机溶剂处理法：通过有机溶剂对细胞膜的作用，使得细胞破碎（Tween,Triton，氯仿等） 酶解法：根据细胞外层结构特点，加适当的酶破坏细胞壁，并在低渗溶液中使细胞破碎 如：霉菌：几丁质酶, 酵母细胞：β－葡聚糖酶 3.生物大分子的提取（抽提） “提取”是在分离纯化之前将经过预处理或破碎的细胞置于溶剂中，使被分离的生物大分子充分地释放到溶剂中，并尽可能保持原来的天然状态不丢失生物活性的过程。 酶的定位不同，其提纯难度也不相同 “固相转入液相”，或“从细胞内的生理状况转入外界特定的溶液中”。 —— 相似相溶 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。 一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中（水、稀酸、稀碱、稀盐溶液等） ，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中 ⑴ 盐溶液提取： 一般以低盐溶液(0.05-0.2mol/L)为主。稀盐溶液和缓冲液对蛋白质的稳定性好，溶解度大，是提取蛋白质和酶最常用的溶剂。 盐溶：在低盐浓度条件下，酶的溶解度随盐浓度增大而增大 盐析：当盐浓度达到一定界限后，酶的溶解度随着盐浓度增大而降低 (2)稀酸（碱）溶液提取 在偏离等电点0.5左右，溶解度增大 根据等电点，选择合适的pH 注意，不能采用极端pH值，操作时要注意避免局部过酸或过碱 (3)变性剂的使用 如：脲、胍等 膜（蛋白）酶，包涵体形式的酶等 有变性剂，蛋白结构松散，易于溶解 去除变性剂，又可恢复原来构象 典型的抽提液组成 离子强度调节剂：蔗糖、KCl、NaCl等 pH缓冲剂：各种缓冲液 温度效应剂：DMSO、甘油 蛋白酶抑制剂：PMSF、亮肽素 抗氧化剂:DTT,巯基乙醇 重金属络合剂：EDTA 增溶剂：Triton-100 （4） 有机溶剂提取 一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶。 常用的有机溶剂有乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等，这些溶剂可以与水互溶或部分互溶，同时具有亲水性和亲脂性，因此常用来提取与脂结合较牢或含非极性侧链较多的蛋白质、酶和脂类。 二、酶分离纯化的基本技术（简介） 溶解度：盐析、沉淀 分子大小：离心、凝胶层析、过滤 电荷：离子交换层析、电泳 亲和性：亲和层析 萃取 结晶 等等 (一)沉淀——