产漆酶真以及漆酶的研究.docVIP

产漆酶真菌以及漆酶的研究 摘要：漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，在细菌、真菌、放线菌、植物中都有报道，但报道最多的为真菌，尤其是白腐真菌。漆酶能够降解环境中的木质素，在纸浆漂白、废水处理中意义重大。漆酶通常情况下漆酶含有4个铜原子结合位点，通过电子在这四个铜原子间相互传递达到分解底物的目的。漆酶基因的异源表达已经吸引了广大学者的目光，至今为止，数十种真菌的漆酶基因已经成功在酵母等异源表达系统中表达，我们可以预见漆酶在人类未来的生活中将发挥重要作用。 关键词：漆酶，白腐真菌，铜原子结合，异源表达 现如今，环境污染已严重影响了人类的生存，造纸厂、纺织厂排出的废水则是重要的污染源之一。木质素是使废水颜色发黑的主要原因[1]，倘若在工厂排出废水前先将木质素出去，将会大大降低废水的毒性。木质素是由聚合的芳香醇构成的一类物质，存在于木质组织中，是世界上第二位最丰富的有机物1.35~1.50 之间，非常坚硬，难溶于各种无机或有机溶剂[2]。木质素属天然芳香族高分子聚合物，是一类在自然界存在量很大但是又较难降解的可再生资源，木质素不含易水解的重复单元，因而不受水解酶的攻击，不仅如此，它还和半纤维素以共价键形式结合，将纤维素分子包埋在其中，形成一种天然屏障，使纤维素酶不易与纤维素分子接触，给纤维素的降解也造成了困难[3]。因此去木质素成为目前人们面临的一大难题。 1 白腐真菌降解木质素 研究表明，在自然界中，木质素的完全降解是真菌、细菌、放线菌及相应微生物群落共同作用的结果。其中，真菌起主导作用[4]，某些真菌能够有效的降解木质素，尤其是白腐真菌（white-rot fungus）可通过一系列的酶促反应实现对木质素的彻底降解。白腐真菌是一类丝状真菌，分类学上属于真菌门，绝大多数为担子菌纲，少数为子囊菌纲。目前，研究最多的是黄孢原毛平革菌、彩绒草盖菌、变色栓菌、射脉菌、凤尾菇等。其中，黄孢原毛平革菌是典型菌种，是研究木质素降解的模式菌，普遍分布于北美，我国尚未发现。 白腐真菌木质素酶系统包括两类三种[4]，一类是是能利用H2O2作电子受体的过氧化物酶类，这类酶包括木质素过氧化物酶(EC 1.11.1.13 Lignin Peroxidase, 简称Lip)和锰依赖过氧化物酶(EC1.11.1.14 Manganese Peroxidase, 简称MnP)；另一类是利用O2作为电子受体的多酚氧化酶类，这类酶称为漆酶(EC 1.10.3.2 laccase, 简称Lac)。以上三种酶各自代表一系列同工酶。木质素过氧化物酶和锰依赖过氧化物酶都是含亚铁血红素的糖蛋白，木质素过氧化物酶分子量大约为40 kD，锰依赖过氧化物酶的分子量一般在38~62.5 kD 之间，它们的血红素辅基埋在蛋白质内构成活性中心(锰依赖过氧化物酶的活性中心尚需一个Mn2+ 和两个起稳定结构作用的Ca2+)；漆酶则是一种以O2作电子受体的含有4个铜离子的氧化酶，分子量在60~80 kD 之间。 2 漆酶催化氧化底物的基理 漆酶最早由一名日本人发现，它并非只存在于微生物界，在细菌、植物中也有报道[5]。漆酶是一种含铜的多酚氧化酶[6]，属于蓝色多铜氧化酶家族，能够氧化多种芳香化合物和其它有机化合物，且副产物只有水，被誉为“绿色酶”。 漆酶一般以单体存在，极少情况下会有同源或异源二聚体，以及同源四聚体。通常情况下漆酶含有4个铜原子结合位点，根据其光谱和磁性特征可将其分为三类，Ⅰ型Cu2+ 一个，呈蓝色，在紫外可见光谱614 nm处有特征吸收，Ⅱ型Cu2+ 一个，非蓝色，没有特征吸收光谱，Ⅲ型Cu24+ 两个，是耦合的离子对，在紫外可见光谱330 nm处有较宽的吸收带。在三类铜原子中，前两种是单电子受体，顺磁性，可用顺磁共振测定，Ⅲ型Cu24+ 是反磁性，无法用顺次共振检测。Ⅰ型Cu2+ 中心相对独立，并且都与两个组氨酸（His）的 N 和一个半胱氨酸（Cys）的S 配位，形成扭曲的四面体结构，其中共价键 Cu-S（Cys）的配位使漆酶呈现蓝色。Ⅱ型Cu2+和Ⅲ型Cu24+ 中心紧密相连形成一个三核铜簇。三核铜簇与8个His 配位结合，其中Ⅱ型铜结合2个His，Ⅲ型铜结合6个His。当然，并不是所有的漆酶都具有四个铜原子。 Ⅰ型Cu2+ Ⅱ型Cu2+ 和Ⅲ型Cu24+ 漆酶催化底物氧化时[7]，Ⅰ型Cu2+ 和Ⅱ型Cu2+ 首先分别从底物接受一个电子，由二价变为一价，然后通过分子内的电子转移，Ⅰ型Cu2+ 和Ⅱ型Cu2+ 将电子传递给Ⅲ型Cu24+ ，它们由一价变成二价，Ⅲ型Cu24+ 由二价变成一价。当Ⅰ型Cu2+ 和Ⅱ型Cu2+ 分别再次从底物接受一个电子变成一价时，四个铜离子都是一价，这时漆酶