实时荧光定量PCR讲解.ppt

* * 常规PCR重要的是终产物的定性分析，虽然有些能够根据中产物半定量，但是不够精确；实时荧光定量PCR则是伴随PCR反应监测每一个循环的产物量变化，通过对数据的分析达到队初始模板进行精确的定量。 * 介绍图 说明指数扩增的重要性 * 人为规定的阈值，去哪一点计算？消除背景干扰，在指数扩增期内， 是为了引入C(t)值概念 实 时 定 量 P C R 技 术Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR 微生物131 沈涛 基本原理： 在RT-qPCR中,对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号,随着反应时间的进行,监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。 在PCR反应早期,产生荧光的水平不能与背景明显地区别,而后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期。RT-qPCR可行性定量是在PCR扩增的指数期进行的。首先需设定一定荧光信号的域值,一般这个域值是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 域值 → Ct ↑ 常规PCR vs RT-qPCR 常规PCR：借助电泳对扩增反应的终产物进行半定量及定性分析 RT-qPCR：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板的定量分析 定量PCR三个基本概念 扩增曲线 指数增长期 平台期 线性增长期 背景期 阈值：是循环开始3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，设定在扩增曲线指数增长期 C(t)值：荧光信号（扩增产物）到达阈值时所经过的扩增循环次数 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 Threshold line C(t) value C(t) value 18.12 +/ - 0.04 C(t) value 18.12 +/ - 0.04 C(t) value 18.12 +/ - 0.04 化学反应原理 依据反应中所选荧光物质的不同,实时荧光定量PCR的化学反应原理通常分为荧光染料和荧光探针两种: 1、SYBR荧光染料: SYBR是一种与双链DNA小沟结合的染料。在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料, SYBR荧光染料特异性掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 2、TaqMan荧光探针:该探针是一种寡核苷酸探针。 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,两端分别标记一个荧光基团和一个淬灭基团。当探针与靶序列配对时,荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时,Taq酶的5-3外切酶活性将探针酶切降解,使荧光基团和淬灭基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 SYBR Green I法 结合双链DNA分子小沟 延伸结束，形成双链DNA，SYBR Green结合到双螺旋小沟中，当受到适合光源激发，发射出荧光，反映产物浓度 优点 使用方便，无需复杂的设计 成本较低 缺点 与非特异性产物结合，无模板特异性 试验方法较难优化 灵敏度低 TaqMan探针法 水解型 报告基团，淬灭基团 FRET（荧光谐振能量传递） 识别特异性产物 优点 特异性高，可准确定量 灵敏度高 设计不同标记的探针，可进行多重检测 缺点 一个探针只适用于一个目标 价格较高 探针设计较繁琐 两种化学的比较 化学试剂 工作原理 有否淬灭剂 信号检测阶段 SYBR Green I 结合于双链DNA的小沟中 否 延伸 TaqMan 水解型杂交探针（5‘-3’外切） 有 任何步骤 RT-qPCR的实验设计和数据处理 绝对定量与相对定量 绝对定量 标准品，标准曲线 已知浓度的相应DNA模板，按不同浓度稀释 根据实时PCR反应得到相应的C(t)，构建标准曲线 样品 与标准品同时进行PCR反应得到未知浓度样品的C(t)值 unknown 104 103 * * 常规PCR重要的是终产物的定性分析，虽然有些能够根据中产物半定量，但是不够精确；实时荧光定量PCR则是伴随PCR反应监测每一个循环的产物量变化，通过对数据的分析达到队初始模板进行精确的定量。 * 介绍图 说明指数扩增的重要性 * 人为规定的阈值，去哪一点计算？消除背景干扰，在指数扩增期内， 是为了引