枯草杆菌感受态细胞的制备及转.docVIP

枯草杆菌感受态细胞的制备及转化1)??将菌种接种在LB平板上37 培养过夜。2)??用接种环接一环菌苔于5mL GM I 溶液，在30 慢摇床（125 r/min）振荡培养过夜。3)??次日取2 mL转接到18 mL GM I 中，37 快摇床（250 r/min）培养3.5 h。4)??再取10 mL上一步骤的培养液转接到90 mL GM II 中，37 慢摇床培养90 min后5,000 g，10 min离心收集菌体。5)??用10 mL原培养液上清液轻轻悬浮菌体，悬浮后的菌体即为感受态细胞可以直接用来转化。6)??感受态细胞的保存：加30%的灭菌甘油至终浓度为10%，混匀后分装到离心管中（0.5 mL/tube），随即放到-70 保存。7)??转化时取出离心管，放在45 水浴中溶化，然后在0.5 mL菌液中加入适量DNA（～1 ug/ml）。8)??于37 振荡（200 r/min）保温30 min后涂布相应抗性平板，再在37 培养过夜，次日检查和验证转化子。枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂[1]??10×最低盐溶液：K2HPO4 70 g，KH2PO4 30 g，（NH4）2SO4 10 g，（Na3C6H5O7?2H2O）5 g，MgSO4?7H2O 1 g，在蒸馏水中依次溶解，加水至500 mL。[2]??氨基酸溶液（根据不同菌株的基因缺陷