2.第二章 基因工程的酶学基础.ppt

* Ⅰ 型（type Ⅰ）限制与修饰系统的种类很少，只占 1% ，如 EcoK 和 EcoB 。其限制酶和甲基化酶 （即 R 亚基和 M 亚基） 各作为一个亚基存在于酶分子中，另外还有负责识别 DNA 序列的 S 亚基。 Ⅱ 型（type Ⅱ）限制与修饰系统所占的比例最大，达 93% 。 Ⅱ 型酶相对来说最简单，它们识别回文对称序列，在回文序列内部或附近切割 DNA ，产生带 3- 羟基和 5- 磷酸基团的 DNA 产物，需 Mg2+ 的存在才能发挥活性，相应的修饰酶只需 SAM 。识别序列主要为 4-6bp ，或更长且呈二重对称的特殊序列，但有少数酶识别更长的序列或简并序列，切割位置因酶而异，有些是隔开的。??? Ⅱs 型（type Ⅱs）限制与修饰系统，占 5% ，与 Ⅱ 型具有相似的辅因子要求，但识别位点是非对称，也是非间断的，长度为 4-7bp ，切割位点可能在识别位点一侧的 20bp 范围内。??? Ⅱ 型限制酶一般是同源二聚体（homodimer），由两个彼此按相反方向结合在一起的相同亚单位组成，每个亚单位作用在 DNA 链的两个互补位点上。修饰酶是单体，修饰作用一般由两个甲基转移酶来完成，分别作用于其中一条链，但甲基化的碱基在两条链上是不同的。??? 在 Ⅱ 型限制酶中还有一类特殊的类型，该酶只切割双链 DNA 中的一条链，造成一个切口，这类限制酶也称切口酶 （nicking enzyme），如 N.Bst NBI 。 Ⅲ 型（type Ⅲ）限制与修饰系统的种类更少，所占比例不到 1% ，如 EcoP1 和 EcoP15 。它们的识别位点分别是 AGACC 和 CAGCAG ，切割位点则在下游 24-26bp 处。????在基因操作中，一般所说的限制酶或修饰酶，除非特指，均指 Ⅱ 型系统中的种类。 * 2．反应温度????反应温度大多数为 37℃ ，一部分为 50-65℃ ，少数 25-30℃ 。高温作用酶在 37℃ 下的活性会下降，多数仅为最适条件下的 10-50% 。如 Taq 限制酶（正常反应温度为 65℃），在 37℃ 只有在 65℃ 活性的 10% ； ApoⅠ（正常反应温度为 50℃）， 37℃ 只有在 50℃ 时活性的 50% 。销售商在产品说明中都会标明最佳反应温度。3．反应时间??? 反应时间通常为 1 小时或更多，许多酶延长反应时间可减少酶的用量。 EcoRⅠ 若反应 16 小时，所需酶量为正常酶切时间的 1/8 ，即若反应时间为 16 小时，则所用酶量为只切 1 小时的 1/8 。其它一些酶也有类似情况，如HindⅢ为1/8；KpnⅠ为1/4；BamHⅠ为1/2。 * 酶加入量不超过总体积十分之一 4．终止酶切的方法????EDTA 可鏊合镁离子，从而可终止酶切反应，终止浓度为 10mM ；加热是常用的方法，对于最佳反应温度为 37℃ 的酶，在 65℃ 或 80℃ 处理 20 分钟可使酶活性大部分丧失。但是对于在 80℃ 作用 20 分钟也有不失活的酶，如最佳反应温度为 37℃ 的酶 Bg1Ⅱ、HpaⅠ 和 PvuⅡ ， 65℃ 酶 Tth111Ⅰ 和 TspRⅠ ，以及 50℃ 酶 Bc1Ⅰ ，可用苯酚抽提去除蛋白，或用试剂盒纯化 DNA 。 关于星活性在后面影响酶活性的影响因素中会详细讲到。 * 需两种酶切同一分子，酶对盐浓度相同，可同时反应。 需两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别不大，中，高盐，可同时反应。利于酶较贵重的盐浓度缓冲液。 两种酶切同一分子，酶对盐浓度要求差别大，低，高盐，不可同时反应。 a) 低盐组先切，加热灭活后，补加盐浓度再切。 b) 沉淀后重新加入另一种盐浓度缓冲液 c）两种酶不能同时反应，有先有后。 首先，ATP/NAD+与DNA连接酶反应，形成酶-AMP复合物。其中，AMP通过一种磷酸酰胺键与DNA连接酶的赖氨酸残基相连，同时释放出焦磷酸（ppi）或烟酰胺单核苷酸（NMN）。AMP激活DNA一条链的5‘末端磷酸基团并转移到磷酸基团上，形成DNA-腺苷一磷酸复合物。最后，3‘-OH对激活的磷原子进行亲核攻击，形成磷酸二酯键，同时释放出AMP。 * 连接反应的效率：主要是取决于反应混合物中 DNA末端的浓度。 插入片段与载体的分子比值为1:1或2:1较合适 * * 先将待测双链DNA 片段中一条单链的一端选择性地进行末端标记, 然后加入恰当浓度的DNase Ⅰ, 使在DNA 链上随机形成缺口, 经变性后电泳分离, 放射自显影, 即可形成以相差一个核苷酸为梯度的DNA 条带. 但当DNA 片段与相应的序列特异性DNA 结合蛋白结合后, DNA 结合蛋白可保护相应的DNA 序列不受DNase