雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤后运动功能障碍..doc

雷帕霉素促进自噬并降低神经组织损伤和脊髓损伤 后的运动功能障碍 摘要: 哺乳动物雷帕霉素的受体(mTOR)是负向调节自噬的丝氨酸/苏氨酸激酶。雷帕霉是mTOR 信号抑制剂，可以促进自噬并在中枢神经系统 (CNS) 的几种疾病中起到神经保护作用。在本研究中，我们评估了小鼠脊髓损伤 (SCI) 后，应用雷帕霉素是否促进自噬，并降低神经组织损伤和减少运动功能障碍。我们的结果表明雷帕霉素的应用大大减少了损伤脊髓组织中p70S6K 蛋白质的磷酸化以及LC3和 Beclin 1 的高表达。此外，损伤脊髓组织中，雷帕霉素组的神经元丢失和细胞死亡率明显低于溶剂对照组。并且，在大鼠后肢运动功能评分--（BMS评分）中，雷帕霉素处理组得分明显高于溶剂对照组。这些结果表明，脊髓损伤后，雷帕霉素通过抑制 mTOR 信号通路，提高自噬水平，并减少神经组织损伤和运动功能障碍。脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗可能成为一种新的治疗策略。 关键词：自噬；Beclin1；LC3；?雷帕霉素靶蛋白(Ravikumar et al., 2004; Schmelzle and Hall, 2000)。它结合于胞质的FK结合蛋白(FKBP12)。雷帕霉素-FKBP12复合物抑制mTOR，阻止p70S6K 和4EBP1的磷酸化(Vignot et al., 2005)。因此，雷帕霉素抑制mTOR从而促进自噬(Kamada et al., 2004;Klionsky and Emr, 2000; Schmelzle and Hall, 2000; Wang and Klionsky, 2003)。 自噬是一种细胞内的分解代谢的机制，通过自噬溶酶体途径降解细胞质成分(Mizushima, 2004)。这种机制对维持稳态起着重要的作用，在某些疾病中起到保护作用(Hara et al., 2006; Liang et al., 1999; Ru-binsztein et al., 2005; Shintani and Klionsky, 2004)。自噬在细胞生长和应激状态下清除或者再利用长寿蛋白和受损的细胞器(Levine and Klionsky, 2004;Shintani and Klionsky, 2004)。已有研究表明，自噬对正常细胞的生长，分化和存活也很重要(Reggiori and Klionsky, 2002; Schmelzle and Hall, 2000)。 新近研究表明，应用雷帕霉素能够增强自噬，在亨廷顿病和帕金森病等某些神经退行性疾病中能够保护神经细胞(Malagelada et al., 2010; Ravikumar et al.,2004)。在这些退行性疾病中，应用雷帕霉素诱导自噬能够增强对聚集蛋白的清除从而减少其毒性(Berger et al., 2006; Webb et al., 2003)。以往的研究表明，在创伤性脑损伤和脑缺血后的神经组织中自噬活动是增强的(Bigford et al., 2009; Diskin et al., 2005; Ramiet al., 2008)。应用雷帕霉素增强自噬的活性并降低脑外伤和新生儿缺氧缺血性脑损伤的神经组织损伤(Carloni et al., 2008; Erlich et al., 2007a)。一些研究也表明，自体吞噬增强可以减少受中枢神经系统（CNS）中受损神经细胞的凋亡(Carloni et al., 2008; Pan et al., 2008)。因此，使用雷帕霉素促进自噬被认为能够在中枢神经系统中起到神经保护功能。 我们此前曾报道，脊髓损伤（SCI）后受损的神经组织中自噬活性显著增强(Kanno et al., 2009b, 2011)。然而，在SCI后受损神经组织中细胞自噬的实际功能目前还不清楚(Kanno et al., 2009c)。此外，雷帕霉素治疗是否能促进细胞自噬和诱导脊髓损伤后受损的神经组织的神经保护功能仍有待阐明。本研究的目的是，应用脊髓损伤小鼠模型，检测脊髓损伤后应用雷帕霉素治疗是否抑制mTOR信号通路，促进细胞自噬。我们还研究了脊髓损伤后，应用雷帕霉素治疗是否可降低脱髓鞘，神经元减少和细胞死亡等神经组织损伤，以及是否提高运动功能恢复。 我们在这里展示，在损伤的脊髓组织应用雷帕霉素治疗可通过抑制mTOR通道显著提高自噬活动。此外，雷帕霉素显著减少脊髓损伤后的神经组织损伤和提高运动功能。因此，应用雷帕霉素可能是一种新的治疗脊髓损伤的策略。 方法： 实验动物 所有的实验程序，通过日本东北大学动物管理和使用委员会的批准。所有的努力都是尽量减少实验动物的用量，并在研究中尽可能地减少动物的痛苦。共58只成年C57BL/6J雌性鼠（10-12周龄）用于