基因工程精品全解.ppt

1。抗药性筛选法 2.营养缺陷性筛选法 载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营养缺陷。 在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的是转化子。 3.显色模型筛选法 LacZ,?-半乳糖苷酶基因，用于筛选重组子。 4.植物细胞中的报告基因：颜色、发光、抗生素、除草剂等 互补显色筛选法：蓝白斑筛选 β-半乳糖苷酶基因的调控序列和前146个氨基酸的编码信息 插入的一个多克隆位点 这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞 宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质，称为α-互补。 由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，α-互补被破坏，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。 ５－溴－４－氯－３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷 互补显色筛选法：蓝白斑筛选 Southern印迹法 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 转移至硝酸纤维素膜上 与放射性标记DNA探针杂交 放射自显影 带有DNA片段的凝胶 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 基因芯片 DNA的Sanger测序法(酶法) 读出模板互补序列 dNTP 凝胶电泳 较大片段 较小片段 ddGTP ddATP ddCTP ddTTP 反应混合物 Klenow酶 未知序列的单链DNA 读出待测序列 CTGACTTCGACAAAGAA 5′ 3′ 放射性标记的引物 TGTT A C T G ddG ddG ddG ddG GACTGAAGCTGTT 3′ 5′ CTGACTTCGACAA 5′ 3′ 测序技术进展同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳 多色荧光标记 毛细管电泳 单色荧光标记 平板电泳 同位素标记 平板电泳 A C G T A C G T 测序图谱 T A TTG CAT TG TC TGCATTG T C T Ti质粒作为载体的问题 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。 有机碱的合成与T-DNA的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因。 Ti质粒约为200kb，重组操作非常困难，也很难找到单一的酶切位点。 Ti质粒不能在大肠杆菌中复制，为了使重组质粒DNA的大量扩增，须添加入大肠杆菌复制子，还需加入植物细胞的筛选标记等。 为利用农杆菌的Ti质粒，发展了共整合系统和双元载体系统，避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。 １、基因工程与医药卫生 我国生产的部分基因工程疫苗和药物 ⑴ 基因工程药品的生产 　　许多药品的生产是从生物组织中提取的。受材料来源限制产量有限，其价格往往十分昂贵。 　微生物生长迅速，容易控制，适于大规模工业化生产。若将生物合成相应药物成分的基因导入微生物细胞内，让它们产生相应的药物，不但能解决产量问题，还能大大降低生产成本。 　　胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。 　将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%! 　　通过基因工程的方式创造了能合成人干扰素的大肠杆菌，每1Kg的培养液可提取20—4０mg干扰素。 干扰素治疗病毒感染简直是“万能灵药”！过去从人血中提取，300L血才提取1mg！其“珍贵”程度自不用多说。 　　　基因工程人干扰素α-2b（安达芬） ，是我国第一个全国产业化基因工程。安达芬具有抗病毒，抑制肿瘤细胞增生，调节人体免疫功能的作用，广泛用于病毒性疾病治疗和多种肿瘤的治疗，是当前国际公认的病毒性疾病治疗的首选药物和肿瘤生物治疗的主要药物。 其它基因工程药物 　　　人造血液、白细胞介素、乙肝疫苗等通过基因工程实现工业化生产，均为解除人类的病苦，提高人类的健康水平发挥了重大的作用。 人造血液及其生产 ⑵ 基因诊断与基因治疗 　诊断：用放射性同位素等标记的“DNA探针”检测肝炎病毒等病毒感染及遗传缺陷，不但准确而且迅速。 我国研究人员正在制备用于基因治疗的基因工程细胞 　治疗：把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。 基因诊断——DNA探针 　概念： 　是用已知序列的DNA或RNA片段作为探针与待测样品的DNA或RNA序列进行核酸分子杂交，用于对待测核酸样品中特定基因顺序的探测，是基因诊断最基本的技术之一。 条件： （1）必须