黄斑海蜇蛋白酶解工艺的研究..docVIP

黄斑海蜇蛋白酶解工艺的研究 实验材料 本实验中所采用的黄斑海蜇购自广西省北海市。将黄斑海蜇用自来水浸泡24小时，不时搅拌并换水，再用流水清洗24小时后，打浆，挤压除水后，以备试验用。 DK-S24 电热恒温浴锅（上海精宏实验设备有限公司、太仓精密仪器设备有限公司）；SPECTRA MR 酶标仪（DYNEX）；美的微波炉（广州美的微波炉制造有限公司）；FA1004N 电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；氮磷钙测定仪(上海洪纪仪器设备有限公司)。 血管紧张素转化酶(ACE)和马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)购自Sigma公司；蒸馏水；0.1 mol/LHCl溶液；0.2125 mol/LPH8.3 buffer；20 g/L硼酸；40%NaOH（质量比）；甲基红指示剂。胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，风味蛋白酶和碱性蛋白酶，购自诺维信生物技术有限公司；胰蛋白酶，购自南宁东恒华道生物科技有限公司；其余试剂为分析纯。 实验方法 蛋白含量的测定 凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。即在有催化剂的条件下，用浓硫酸消化样品将有机氮都转变成无机铵盐，然后在碱性条件下将铵盐转化为氨，随着水蒸气蒸馏并被过量的酸吸收。由于蛋白质含氮量比较恒定，可根据其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。 取两支干净的消化管，一支加入黄斑海蜇预处理样品1.g，另一支不加蛋白粉作为空白对照，其余操作相同。分别加入CuSO4·5H2O 0.5 g和K2SO4 3 g，加浓硫酸15 mL，在消化炉中消化1.5 h后冷却，固体呈现白色，略混有晶体，将其转移至100 mL容量瓶。取锥形瓶加入20 g/L的硼酸15 mL，滴入2滴甲基红指示剂，并加入5 mL样液，10 mL NaOH。将锥形瓶转移至凯氏定氮仪中进行吸收，指示剂变绿色后继续蒸馏10 min，将冷凝管尖端提离液面继续1 min。 用0.1 mol/L HCL标准液进行滴定，到达滴定终点时锥形瓶中的溶液由蓝色变成无色，且溶液颜色保持1 min不变色，记录此时试验管和空白管所消耗的HCl标准液的体积。 X% =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) *F*100%　 　　 X：样品中蛋白质的百分含量； 　　 V1：样品消耗盐酸标准液的体积，mL； 　　 V2：试剂空白消耗盐酸标准溶液的体积，mL； 　　 N：盐酸标准溶液的当量浓度； 　　 0.014：1N盐酸标准溶液1mL相当于氮克数； 　　 m：样品的质量（体积），g（mL）； 　　 F：有机氮换算为蛋白质的系数。 2.2 氨基酸组成分析测定 按照国标GB/T5009.124-2003测定，海蜇的氨基酸组成。 ACE抑制活性的测定 取ACE30 μL，样品溶液25 μL(空白溶液用25 μLbuffer缓冲溶液代替)，37℃00 μL5 mmol/L马尿酰组氨酰亮氨酸(HLL)37℃反应60 min，加入200 μL1 mol/L终止反应。反应液中加入1 mL乙酸乙酯振荡15 s后，取上清液0.8 mL，95℃烘干1 h后，再加入0.5 mL水溶液，228 nm测定吸光度。ACE抑制率按照下式计算。 抑制率(%)= ×100% 50℃搅拌酶解不同时间(2, 3, 4, 5, 6 h)，开水煮沸10 min灭酶，4000 rpm/min离心10 min，取上清液测定ACE抑制率。 取黄斑海蜇处理样品10 g，加入30 mL水，按照E/S为5%，在不同温度下(40, 45, 50, 55, 60℃)搅拌酶解4 h，开水煮沸10 min灭酶，4000 rpm/min离心10 min，取上清液测定ACE抑制率。 取黄斑海蜇处理样品10 g，加入30 mL水，按照不同酶与底物比(E/S, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%)，50℃搅拌酶解4 h后，开水煮沸10 min灭酶，4000 rpm/min离心10 min，取上清液测定ACE抑制率。 2.6 响应面分析实验 在单因素考察的基础上，确定了酶解时间(X1)，酶解温度(X2)和E/S(X3)的考察水平(表2)，进行了三因素三水平的响应面分析实验，进行酶解条件的优化，每个实验重复三次。 2.7 黄斑海蜇蛋白酶解产物的分析 采用高效液相色谱法，对按照优化工艺所得的黄斑海蜇的蛋白酶解产物进行分析μl分析。色谱条件如下：色谱条件:色谱柱: ZORBAX SB-C18(4.6×150 mm, 5 μm)。流动相：表2 响应面分析因素及水平表 因素 ℃ ) 45 50 55 E/S(C, %) 4 5 6 3. 实验结果 3.1 蛋白含量的测定 利用凯氏定氮法测定，的含量为±0.723%。 图1 6种蛋白水解酶对黄斑海蜇酶解产物ACE抑制活