1。2基因工程基本操作终稿.ppt

1.2基因工程操作的基本步骤 一、基因工程的原理是什么? 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品 二、基因工程操作的基本步骤 讨论分析基因工程操作每个步骤的必要性 基因工程操作程序中每一步的必要性 1、没有第一步，就谈不上按照人们的愿望来改造生物性状。 2、没有第二步，目的基因就不能在受体细胞中稳定存在和稳定遗传，更谈不上在受体细胞中表达。 3、没有第三步，就不能实现一种生物的基因在另一种生物中转化。 4、没有第四步，就不知道目的基因是否真正导入受体细胞，是否真正能够在受体细胞中正确表达。 目的基因： 获取目的基因的方法一 直接分离基因——鸟枪法 目的基因的存储 获取目的基因的方法二 利用PCR技术扩增（快速获取大量目的基因） 讨论： PCR技术扩增DNA和体内DNA复制条件是否可以完全相同？（阅读P10相关材料） 讨论： PCR技术扩增DNA和体内DNA复制条件是否可以完全相同？（阅读P10相关材料） 利用PCR技术扩增（快速获取大量目的基因） 1、调温到90~95度，使双链间的氢键打开。变成单链DNA，作为互补链聚合反应的模板。 2、调温到55~60度，使两处引物分别与模板DNA链3’端的互补序列互补配对 3、调温到70~75度在酶的作用下、将与模板互补的单个核苷酸加到引物所提供的3-OH上，使DNA链延伸，产生一条与模板链互补的DNA单链 基因表达载体的构建 2、构建零件及作用 目的基因 启动子 终止子 标记基因 目的基因与运载体结合 用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。 将目的基因导入受体细胞 常用方法： 1、导入植物细胞的方法——农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法 2、导入动物细胞的方法——显微注射技术 3、导入微生物细胞方法——Ca+处理大肠杆菌 将目的基因导入受体细胞并扩增 1、基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。 2、导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。 3、目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大量的基因。 目的基因的检测和表达 1、检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因 2、检测目的基因是否转录出了mRNA 3、检测目的基因是否翻译成蛋白质 三、小组讨论设计 结 束 语 基因工程过程示意图 几种限制性内切酶 DNA连接酶的作用过程 DNA连接酶的作用原理 质 粒 目的基因与质粒的连接 【解题关键】解答本题时明确以下两点： （1）明确本题中的目的基因是腺苷酸脱氨酶基因。 （2）牢记质粒作为运载体的条件，其中至少有一个限制性核酸内切酶识别位点。 【标准解答】选C。A项，ada为目的基因，大肠杆菌为受体细胞，将目的基因导入大肠杆菌时如果能成功表达说明每个大肠杆菌细胞至少含一个重组质粒； B项，要让目的基因与质粒形成重组质粒，两者必须用同种限制性核酸内切酶切割，所以每个重组质粒至少含一个限制性核酸内切酶识别位点； C项，质粒作为运载体的条件之一是有多种限制性核酸内切酶的识别位点，但每种限制性核酸内切酶只有一个识别位点，只能插入一个目的基因（ada）； D项，ada导入大肠杆菌成功的标志是表达腺苷酸脱氨酶，因此每个插入的ada至少表达一个腺苷酸脱氨酶分子。 【变式训练】下列关于基因表达载体构建的相关叙述，不正确的是( ) A.需要限制酶和DNA连接酶 B.必须在细胞内进行 C.抗生素抗性基因可作为标记基因 D.启动子位于目的基因的首端 【解析】选B。基因表达载体构建是将目的基因与载体结合，在此过程中需用同一种限制酶切割目的基因与载体，用DNA连接酶将相同的末端连接起来；基因表达载体的构建是在细胞外进行的；基因表达载体包括启动子(位于基因首端使转录开始)、终止子、目的基因和标记基因(鉴别受体细胞中是否含有目的基因，如抗生素抗性基因)。 将目的基因导入受体细胞 将受体细胞进行扩增 【典例3】农杆菌是一种在土壤中生活的微生物，能在自然条件下感染植物，因而在植物基因工程中得到了广泛的运用。如图为农杆菌转化法的示意图，试回答下列问题： (1)一般情况下农杆菌不能感染的植物是_____，利用农杆菌自然条件下感染植物的特点，能实现_____。 具体原理是在农杆菌的Ti质粒存在T-DNA片段，它具有可转移到受体细胞并整合到受体细胞的_____上的特点，因此只要将携带外源基因的DNA片