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骨髓间充质干细胞促进皮肤创伤愈合的研究 【摘要】 目的：探讨骨髓间充质干细胞（MSCs）在组织工程皮肤修复创面缺损中的作用. 方法：以标记了PKH26的MSCs为种子细胞构建组织工程皮肤，修复皮肤缺损，HE染色和免疫组织化学染色观察愈合效果，荧光检测追踪细胞转归. 结果：移植2 wk后实验组创面基本愈合，愈合时间明显快于对照组，6 wk时仍可检测到红色荧光标记的骨髓间充质干细胞，免疫组织化学染色显示角蛋白和Ⅰ型胶原表达阳性. 结论：含有MSCs的组织工程皮肤移植后促进创面愈合，骨髓间充质干细胞在皮肤创伤愈合中起了重要作用，可作为组织工程领域中理想的种子细胞. 【关键词】 骨髓间充质干细胞；皮肤；创伤愈合；组织工程 　　0引言 　　随着组织工程技术的发展，开发构建组织工程皮肤逐渐引起人们的关注，但种子细胞的来源是目前困扰组织工程的问题之一. 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是近年来研究的一个热点，它来源于中胚层，有较强的自我更新和增殖能力，且取材方便，易于培养，不涉及伦理道德等问题，因而被认为是组织工程理想的种子细胞［1］. 本研究拟用MSCs作为种子细胞经体外培养扩增后构建组织工程皮肤，修复动物皮肤缺损，观察修复效果及细胞在体内的分化，为构建具有生理功能的组织工程皮肤奠定基础. 　　1材料和方法 　　1.1材料 　　无菌条件下从猪髂骨处抽取骨髓，采用Percoll（Sigma）分离法，经密度梯度离心收集界面层的单个核细胞，PBS洗两次，离心收集细胞，重悬于体积分数为100 mL/L胎牛血清的DMEM/F12培养液进行培养，隔日换液，弃去未贴壁的细胞，待贴壁细胞继续培养达80%~90%融合时，用胰蛋白酶消化，传代培养. 使用前用PKH26荧光染色试剂盒（Sigma）进行荧光标记. 标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光. 取用荧光标记过3~5代状态良好的骨髓间充质干细胞，以1.8×106/mL的密度与提取自小牛皮的Ⅰ型胶原混合，37℃孵育30 min凝固后，加入培养液培养，2 d将其移至气液面进行器官培养，继续培养2 d获得含有MSCs的组织工程皮肤［2］. 　　1.2方法 　　1.2.1动物创伤模型制备及移植实验 　　实验用猪6只，雌雄不限，质量17~20 kg. 麻醉后背部剃毛，消毒. 在每只猪脊柱两侧皮肤各制备2个直径50 mm的圆形皮肤缺损，深至筋膜层，建立深层皮肤缺损动物模型（n=24），自体双侧对照，左右随机分为实验组和对照组. 实验组将构建的组织工程皮肤覆盖创面，敷以无菌油纱和普通纱布，打包缝合. 对照组创面未覆盖组织工程皮肤，其它治疗同实验组. 术后1 wk首次打开创面，常规换药. 　　1.2.2创面观察及指标 　　术后动物分笼饲养，每天观察活动、饮食等情况，连续观察创面变化、组织生长和创面愈合等情部至第6 wk. 定期取创面组织进行组织学观察，冰冻切片进行显微镜检查，免疫组织化学染色观察角蛋白（CK）和Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ）形成情况. 　　2结果 　　2.1骨髓间充质干细胞原代细胞接种后成圆形，首次换液后显微镜下可见稀疏分布的单个细胞贴壁生长，细胞为纺锤形，类圆形，7 d后生长速度加快，呈典型的成纤维细胞外观，约10 d汇合成片即可传代. 标记好的细胞在荧光显微镜下呈单个类圆形的红色光点，显示较强的荧光. 　　2.2组织工程皮肤光镜下可见体外培养的组织工程皮肤，与正常皮肤的真皮部分相似，表皮层缺如，真皮层较厚，但组织工程皮肤中缺少毛囊、汗腺和血管结构等. 　　2.3术后大体与组织学观察所有实验动物到实验结束均存活，饮食、排便正常，没有术后感染、化脓、体液渗出等不良反应. 在移植后1 wk，MSCs复合的组织工程皮肤与自体皮肤较好的融合，移植物颜色与自体皮肤颜色接近，随着时间延长，移植物中毛细血管的数量逐渐增多，上皮角化不明显；移植后2 wk， 创面基本愈合，移植物颜色与自体皮肤颜色非常接近，瘢痕小，上皮增厚，角化明显，真皮层细胞生长良好，毛细血管大量增生. 对照组未完全愈合，移植区瘢痕形成，颜色较深，到移植后第3 wk才以瘢痕愈合. 实验组和对照组创面的愈合时间分别为（14.2±1.5） d和（20.4±2.7） d，两组间差异有显著性（Plt;0.05）.我们对新形成皮肤组织中的毛细血管进行了计数，发现在第6 wk实验组明显高于对照组（Plt;0.05,图1）. 　　2.4荧光检测荧光显微镜对实验组的组织标本进行连续检测6 wk，可在皮肤组织的表皮层，真皮层和皮下脂肪层的血管周围观察到标记了红色荧光的细胞. 　　2.5免疫组织化学