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电泳技术 段天璇 一、基本理论 1. 常用公式和术语 E=U/L 电场强度(V/cm)=电压(V)/电极间距(cm) *相对迁移率 mR=蛋白质迁移距离/示踪染料迁移距离 μep=v/E =l/(tE)=lL/(tU) =q/(6πrη) (cm2/(s*V) ∵F=qE =F’=6πrηv l：蛋白质迁移距离 电泳速度 v=μepE=μepJ/K 分离度 影响电泳的环境因素 电泳速度 v=μepE= εζE/(Cη) C: 6πor 4π E pH: pI(~4-7), 缓冲溶液pH(~8-9.5), 向？极泳动 离子强度I: 0.02-0.2 电渗 温度：焦耳热 介质：孔径、制胶重复性等 2. 分类 按原理: 区带电泳, (移界电泳), 稳态电泳, 显微电泳 3. 电泳仪及附属设备 提供稳定直流电源的装置 电压、电流、电功率稳定 脉冲式 电压 常压电泳仪(600V): 净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 高压电泳仪(3kV): 载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序 超高压电泳(30-50kV): 毛细管电泳 电泳槽 板状电泳槽 水平板 垂直板 管状电泳槽 *自由界面电泳槽 4.电泳的支持介质 特性（要求） 物理化学性质稳定 化学惰性 均匀 种类 5.检测-染色方法 考马斯亮蓝：常用 荧光染料：灵敏 硝酸银：灵敏 酶活性 免疫学：专一 特殊蛋白质 糖蛋白、脂蛋白、铁蛋白、铜蛋白 三苯基甲烷衍生物，-SO3--蛋白质的碱性基团——染料-蛋白质复合物。 R型 G型二甲花青亮蓝-甲基取代的三苯基甲烷衍生物 染色 固定蛋白质-染色-脱色 同时固定和染色-脱色 脱色 30%甲醇的10%乙酸溶液等 二、琼脂糖凝胶电泳agarose gel electrophoresis 支持介质：琼脂糖 结构：1,3连接的β-D半乳糖和1,4连接的3,6脱水α-D半乳糖线性联结成琼脂糖，琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成交联结构 特点：大孔胶，适于核酸、线性DNA, RNA分离分析 分离原理：0.2-50kb 操作形式：水平电泳、免疫 电泳、平板等电聚焦 性能指标 电内渗、胶凝温度、熔化温度、凝胶强度、脱水收缩作用 纯度：硫酸根含量少，纯度高 应用：核酸研究, 不同浓度凝胶分离 200bp-50kb DNA 检测：荧光染料溴乙啶，电泳后染色 操作过程： 见Agarose Gel Electrophoresis.ppt 三、醋酸纤维素薄膜cellulose acetate film 纤维素-乙酰化 特点 定量准确性提高：吸附少、染色背景脱色 较快速：电渗小 灵敏度高，样品用量少：5微克蛋白质 薄膜可保存 操作简单快速价廉 应用领域：血浆蛋白、脂蛋白、糖蛋白、脱氢酶、多肽等 四、聚丙烯酰胺凝胶电泳 PAGE 以polyacrylamide gel为分离介质 分离原理：电荷密度+分子筛 特点 应用领域 操作形式 (圆盘电泳) 垂直板电泳 水平板电泳 1.聚丙烯酰胺凝胶polyacrylamide gel, PAG 聚合 化学聚合 光聚合 总浓度与交联度 总浓度与交联度的影响 凝胶浓度 T=[(a+b)/m ]100% (g/mL) 交联度 C= [b/(a+b) ]100% a=mAcr; b=mBis; m=V a/b：凝胶性状、孔径、分子筛效应等 C=6.5-0.3T 浓度筛选：标准凝胶T=7.5%或梯度胶 凝胶孔径 2. 连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(1959) 凝胶孔径、缓冲液（样品、凝胶、电极）不变 分离原理：样品电荷 特点：制胶简单、条件简单恒定、分辨率不高 适用：简单样品 3. 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 含义：不同胶孔径、不同缓冲液 分离原理：电荷效应+分子筛效应 特点：样品成分浓缩-分离，分辨率高；操作复杂 适用：广泛应用的主要电泳技术 3种物理效应 样品浓缩；分子筛效应；电荷效应 不连续性 凝胶浓度：浓缩胶-分离胶 缓冲液离子成分 缓冲液pH 电位梯度 制胶 4. SDS十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离原理: 分子筛-分子相对分子质量 蛋白质-SDS复合物呈棒状且大量带电(-),消除样品蛋白质分子间电荷差异 应用：蛋白质纯度检测和相对分子量测定 操作形式：多用垂直管或垂直板，不连续系统，或梯度胶 SDS操作特点 样品: 制胶： 缓冲液：分离、浓缩胶缓冲液均含SDS 等 分子量的确定 染色 考马斯亮蓝-蛋白质吸附量-近似Beer定律 其他染色 计算标准蛋白质mR，作lgMr-mR标准曲线 待测蛋白mR - Mr 5. 梯度凝胶电泳 分离胶浓度为线性或指数梯度 分离原理：蛋白质分子大小 T 4-30%, Mr 5万-200万，分辨较小Mr差异 可不与SDS反