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酵母双杂交体系的新发展 　摘要 酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的一种有效方法。本文简要介绍了双杂交体系的原理、应用和自身存在的问题，并对其最新发展做了重点阐述。 　　关键词 酵母双杂交系统，蛋白质一蛋白质间相互作用 　　自从Fields和Song[1]首先描述了酵母双杂交系统（yeast two-hybrid system），这一研究蛋白质间相互作用的新技术已经得到了广泛的应用。它的可行性、有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白特异作用的候选蛋白的研究中已被证实并被推广到了诸如细胞周期调控、信号传导、肿瘤基因表达等多个研究领域，受到越来越多的重视。随着日益广泛的应用，人们也不断地对这一技术进行了完善和发展。 　　一、酵母双杂交体系的原理及应用 　　真核细胞基因转录激活因子的转录激活作用是由功能相对独立的DNA结合结构域（binding domain,BD）和转录活化结构域（activation domain,AD）共同完成的[2]，这两个结构域通过共价或厞共介连接建立的空间联系是导致结合和激活发生的关键[3，4]。根据这一特点，如果使可能存在相互作用的两种蛋白X和Y分别以和BD/AD形成杂合蛋白的形式的酵母中表达分布于细胞核中，X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。根据这一原理，双杂交系统通过简便的酵母遗传分析对报告基因表型进行检测即可实现对于蛋白质间相互作用的研究。 　　迄今为止，应用于筛选基因的双杂交体系已发展出很多版本。以较早发展起来的Y190为例，它采用了GAL1-HIS3，GAL1-LacZ双重报告基因，其中启动子GAL1由包含转录因子Ga14的BD特异识别位点的上游激活序列UAS和基础启动子（minimai promoter）组成。营养筛选适于作为初筛处理大理筛查对象；颜色筛选则是对杂合蛋白复合体转录激活功能的再验证，易于排除部分假阳性。在酵母Y190中，由于HIS3基因的TATA盒中具有不受GAL1上游激活序列调控的低水平启动转录功能，就使得通过颜色进行再次筛选尤为重要。用于双杂交筛选的表达质粒载体如Ga14系列除能表达BD或AD与“诱饵X”或“猎物Y”融合的杂合蛋白外，还在该杂合蛋白的N端添加了SV40的核定序列（nuclear localization sequence），使该内的蛋白量可以满足检测的灵敏度需量。经验证明，应用不同体系进行检测的灵敏差异主要取决于控制报告基因表达的启动子和DNA结合序列的特点以及两种融合蛋白在酵母中的表达量[11]。 　　作为一种高度敏感[5]、适用于细胞核内外以至于细胞内外多种蛋白质在体研究体系，双杂交系统主要应用于：①验证通过其他方法发现的蛋白质间可能的相互作用；②确定蛋白质特异相互作用的关键结构域和氨基酸；③筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的蛋白质。由于具有相对简便、快速及不经蛋白质纯化即可相接获得编码基因的特点，采用双杂交体系从cDNA文库和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用成为它最具优势之处。由此而鉴定的各种受体、转录因子、蛋白激酶、磷酸化酶、细胞骨架蛋白以及参与细胞周期调控、肿瘤发生的蛋白质已不胜枚举[6-10]。 　　二、双杂交系统的缺陷 　　尽管已被证实为一种非常有效的方法，双杂交系统也有自身的一些问题和缺点：首先，它并非对所有蛋白质适用。由其原理所决定，融合蛋白的相互作用激活报告基因转录是在细胞核内发生的，而表达的融合蛋白在细胞内能否正确折叠并运至核内是检测的前提条件。虽然目前已经在表达质粒中插入了核定位序列，但傜不能排除不少必须经过内质网等细胞器进行翻译后加工修饰的蛋白质尤其是胞外蛋白不能进入核内，或因产生错误的构象而影响筛查结果[12]。其次，假阳性的发生较为繁多，在筛库过程中遇到的假阳性可被简单分成三型[3]：Ⅰ型：表达单独的AD-Y融合蛋白即可激活转录。Ⅱ型：表达AD-Y融合蛋白和空BD载体即可激活转录。Ⅲ型：表达AD-Y融合蛋白与任意BD融合蛋白即可激活转录。这其中部分假阳性来源于 筛选对象具有类似转录因子的功能，或在双杂交体系中能表现出这种特性。再次，部分假阳性原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。最后，在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质常会带来毒性作用，从而影响菌株生长及报告基因的表型。为了抑制背景表达而在培养其中添加的3-AT（3-Aminotriazole)或6-Azauracil也对菌株有一定毒性