生育酚结合蛋白通过磷酸肌醇3激酶途径抑制前列腺癌的生长.docVIP

生育酚结合蛋白通过磷酸肌醇3激酶途径抑制前列腺癌的生长 作者：温星桥，李小娟，罗云，王林，周祥福，蔡育彬，温机灵，高新 【摘要】 【目的】 探讨生育酚结合蛋白(TAP)对前列腺癌细胞的生长调节及其分子机制。【方法】四甲基偶氮唑盐生长试验(MTT)测定细胞增殖情况，体外集落形成试验测定各细胞的致癌能力，高效液相层析法检测细胞内维生素E的浓度，利用基因转染、基因沉默、免疫印迹、Northern blot, RT-PCR、荧光定量PCR、免疫沉淀等方法研究TAP对前列腺细胞生长的作用及机制。【结果】 TAP mRNA水平在前列腺癌细胞 LNCaP、PC-3、DU-145、CWR22R中均较正常前列腺细胞RWPE-1低。TAP 可促进癌细胞保留维生素E并增强其抗前列腺癌增殖的效应。无维生素E作用下，转染TAP可抑制前列腺癌细胞LNCaP、DU-145的生长，第6天细胞数比对照组分别减少35.8％与42.4%；LNCaP细胞克隆形成率下降54.3％（Plt; 0.05）。利用siRNA在良性前列腺细胞 HPr-1中沉默TAP基因，培养9 d后，细胞数比对照组增加124.3％（Plt; 0.01）。TAP通过抑制磷酸肌醇PI3激酶信号，而非通过影响细胞周期或雄激素受体信号发挥作用。免疫沉淀实验表明TAP通过抑制PI3K的亚单位p110与p85的相互作用，进而干扰PI3K-Akt信号通路；持续激活Akt的活性可削弱TAP对前列腺癌细胞生长的抑制能力。【结论】 TAP不仅能促进前列腺癌细胞摄取和增强维生素E的抗前列腺癌效应，还可通过非维生素E途径发挥作用，可能是防治前列腺癌的有价值的分子靶点。 【关键词】 生育酚结合蛋白； 前列腺癌； 磷酸肌醇3激酶 前列腺癌的发病除与种族、遗传因素有关外，还与营养及饮食结构等多种因素有关。近来有多项大型多中心临床研究表明维生素E可降低前列腺癌的发病率[1，2]。α-生育酚结合蛋白(α-tocopherol-associated protein, TAP)是新近识别出来的、能与α-生育酚（维生素E的一种活性最强的存在形式）特异性结合的新蛋白，主要表达于肝、脑、前列腺等器官。TAP在前列腺癌发病的作用机制未明。前期研究发现TAP可参与吸收、转运维生素E[3，4]。本研究旨在通过体外实验探讨TAP对前列腺癌生长的作用和分子机制。 1 材料和方法 1.1 细胞来源 LNCaP、PC-3、DU-145和RWPE-1细胞（由转染乳头状病毒HPV18而永生化的正常前列腺外周带的上皮细胞）从美国ATCC（American Type Culture Collection）购买；CWR22R细胞来自Dr. CH Kao(美国Indiana University)；HPr-1细胞（由转染乳头状病毒HPV16 E6/E7而永生化的正常前列腺细胞）来自Dr. YC Wong (University of Hong Kong)。 1.2 化学试剂 α、γ-生育酚（α、γ-tocopherol）、Flag-M2抗体购自美国Sigma公司；PI3K p110、phospho-FOXO3a、Akt和actin抗体购自美国Santa Cruz公司；FOXO3a 和 PI3K p85 抗体购自Upstate Biotechnology 公司；抗Ser473抗体购自Cell Signaling Technology 公司。雄激素受体抗体和pCDNA3-cAkt质粒来源如文献报道[5]。 1.3 质粒构建 从前列腺增生细胞的cDNA中分离全长TAP序列, 克隆入pCDNA3-flag载体，用pMSCV/U6（包含有抗puromycin 的标记，来自Dr. P.Silver, Harvard Medical School），构建TAP siRNA寡核苷酸链GCATGTGGAGTTCCGAAAGTTCAAGAGACT TTCGGAACTCCACATGCTTTTTT，克隆入pMSCV/U6质粒的ApaI-EcoRI位点，构建成pMSCV/U6-TAPsiRNA，所有构建产物均通过测序证实。 1.4 质粒转染 用脂质体转染法（SuperFect，购自Qiagen公司）或者电转染法。电转染 (机器购自Bio-Rad公司)，用悬浮在体积分数2.5% FBS (不含抗生素)的对数生长期细胞，浓度为107个细胞/mL，参数设置：电压280 mV，电容 950 μF，样本容积400 μL，每次转染DNA总量10 μg。 1.5 细胞培养 LNCaP、PC-3和CWR22R细胞以含体积分数10%胎牛血清（fetal bovine serum,