体外DNA连接.pptx

实验五体外DNA连接原理利用DNA连接酶把目的DNA片段和载体DNA连接在一起，成为一个新的重组分子。 材料载体目的DNA片段内切酶连接酶载体具有复制起点具有抗菌素抗性基因具有若干限制酶单一识别位点具有较小的分子量和较多的拷贝数目的DNA片段PCR产物经限制性内切酶消化。PCR产物直接用于连接反应限制性内切酶消化PCR产物直接连接到T载体限制性内切酶限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（一般4-8bp），并在此处切割DNA双链的核酸内切酶。主要存在于原核生物，是原核生物自我保护的一种机制（限制修饰系统）。 属 系 株 序限制性内切酶命名限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。Hin dⅢHaemophilus influenzae d株流感嗜血杆菌d株的第三种酶第1个字母取自产生该酶的细菌属名，大写第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写第4个字母代表株最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号限制性内切酶的类型根据限制性内切酶的识别位点和切割位点以及所需要的辅助因子，可将目前已鉴定出的限制性内切酶一般将限制酶分为3种不同类型。I 型：切割位点不确定，不适用于基因工程。Ⅱ型：基因工程的工具酶。Ⅲ型：切割位点不在识别位点，对分子克隆操作 亦无实用意义。II型限制性内切酶 首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌Rd菌株中分离出来。 作用原理：识别双链DNA上未甲基化修饰的一 小段明确的序列（多数是回文序列），然后在识别位点之内的特定位置切割。 一般性状 对热不稳定，通常是溶于含有50％甘油的缓冲液中贮存于–20℃环境下。取出使用时必须立即置于冰浴中。NaCl有抑制作用，能被Mg2+激活，巯基有保护作用， 识别序列 通常识别的是4-8bp的回文序列，多为6bp，在识别序列内或其附近水解DNA链中的磷酸二酯键。酶切切口 齐平末端：在识别序列内的对称轴上切割，其 切割产物具平头末端（不易重新连接）。粘性末端：在识别序列2条链对应位上错位切割，有5’端突出的粘性末端和3’端突出。粘性末端的意义：粘性末端突出的单链部分可以与相同的酶或同尾酶切割得到的粘性末端的单链部分互补配对。齐平末端 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端）粘性末端5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAppAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端）粘性末端5’-CTGCA?G -3’ 3’-G?ACGTC -5’ 5’-CTGCAG -3’ 3’--5’ GACGTC Pst I的识别序列和酶切切口（粘端）PCR产物双酶切连接利用限制性内切酶的连接PCR产物T载体连接实验原理普通Taq酶会在3′末端加一个A，这样所有PCR产物都会在双链DNA的3′端均有一个单链状态的A；T－载体是线状DNA片段，在DNA双链的3′端均有一个单链状态的T；二者在连接酶的作用下连接为一个重组的环状分子，从而达到克隆的目的。PCR产物dNTPTaq DNA聚合酶ATATTATApMD19－T 载体的结构T4 DNA 连接酶可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以/view/82140.htm磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子。同时T4 DNA连接酶可以修补双链DNA、双链RNA或DNA/RNA杂合物上的单链缺刻(single-strand nicks)。实验材料pMD-19T 载体试剂盒反应体系试剂体积（ul）pMD-19T 载体0.5目的片段XddH2O to 5solution I5室温放置半小时或4℃链接过夜核酸内切酶分为单链DNA内切酶和双链DNA内切酶。能定点切割DNA双链的内切酶称为限制性内切酶。限制：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。修饰：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。限制酶概念提出的背景： 20世纪30年代，微生物学家发现，微生物的噬菌体不能交叉感染，如E coli K株的噬菌体只能感染 E coli K株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。 1962年，W．Arber提出一个假设来解释上述现象。他认为这是细菌中有2种以上功能不同的酶，一 种是核内切酶，能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限