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糖尿病小鼠肝线粒体氧化损伤及其机制 作者：张蕾 庄晓燕 陈顺志 白秀珍 刘树森 【摘要】 　　目的: 糖尿病是威胁人类健康的主要疾病之一，为了证明糖尿病的发生发展与氧化应激密切相关，从线粒体呼吸链角度探讨其机制。方法：用四氧嘧啶(Alloxan)建立实验性糖尿病小鼠模型，利用比色法分别从整体、组织和线粒体水平测定抗氧化酶活性，用铁氰化钾脉冲法测定线粒体呼吸活链II+III电子传递与质子泵出偶联（H+/2e）。结果： 糖尿病小鼠GSH、 GSHPx分别比对照组显著降低（Plt;0.001），血清和肝组织、线粒体GSHPx/MDA 比值分别降低59.89%、40.69% 和59.65%；线粒体呼吸链II+III总H+/2e显著降低24.76%(Plt;0.05)，净H+/2e显著降低32.31%(Plt;0.05)。结论：实验性糖尿病小鼠肝功能损伤是氧化性损伤，氧化应激又是该损伤的结果，其原因与质子漏增加，电子传递与质子泵出脱偶联有关，导致自由基增加，无效耗氧增加，线粒体受损。 【关键词】 线粒体； 呼吸链； 糖尿病 　　现国内外一系列动物实验和临床研究表明糖尿病存在着明显的氧化应激［1］，确切原因尚不清楚，主要可能由于：①自由基产生增加。葡萄糖及糖化血红蛋白自氧化可产生自由基，线粒体结构、功能的损伤造成呼吸链电子传递与质子泵出偶联程度下降，电子漏增加,自由基生成增加。② 机体清除自由基系统功能减弱［7］。原因是抗氧化酶活性降低,抗氧化物质血浓度降低。正常情况下体内清除自由基的酶类如：SOD、GSHPx和小分子抗氧化剂如VitE、VitC、胡萝卜素、GSH及微量元素(硒、锌)对自由基及脂过氧自由基的清除能力减弱。③葡萄糖自动氧化产生的酮醛也可以进一步氧化修饰蛋白质，导致蛋白质结构和功能的改变而参与氧化应激［8］。氧化应激可进一步因组织损伤，细胞死亡以及自由基清除能力降低而加强。 　　近代生物学研究表明，线粒体不仅是细胞能量转化的中心，也是细胞内自由基的主要来源。线粒体电子漏作为机体自由基生成的重要途径，其重要性及生理意义已在生物力能学和自由基与医学领域内受到广泛关注。对线粒体电子漏的研究表明，它在生物衰老、疾病发生发展、细胞程序死亡中起着重要的作用。线粒体耗氧的2%～6%转化为自由基，包括超氧阴离子、单线态氧、羟自由基和过氧化氢等。活性氧在体内具有多方面的病理生理意义。一方面，它通过直接或间接途径参与许多疾病的发生与转归过程［2］；另一方面，它又是正常的生理代谢产物，是生命活动所必需的［2］。因此生物体自由基的产生与清除的平衡，对维持体内维持体内生理性低浓度活性氧，又防止其浓度过高造成机体损伤是极其重要的。 　　综上所述,本研究从自由基的产生及清除两方面研究了糖尿病与氧化应激的关系，进一步探讨了自由基与糖尿病肝损伤的机理。 　　1 材料与方法 　　1.1 实验性糖尿病模型的建立 　　1.1.1 实验动物 雄性昆明小白鼠，体重30±5g, 由中国科学院动物研究所试验动物中心提供，饲以该所提供的复合饲料。 　　1.1.2 Alloxan试剂的配制［3］ Alloxan 应避光0～4℃ 保存，现用现配将Alloxan配制成1%的生理盐水溶液。 　　1.1.3 糖尿病动物模型建立［4］ 选择健康昆明白小鼠20只（30±5g),饥饿24h后，尾静脉注射Alloxan无菌盐水注射液75mg/kg；对照组注射生理盐水溶液，72h后，用 One Touch2血糖仪测空腹血糖FPGgt;200mg/ml,初步确定为糖尿病模型。 　　1.1.4 长期高血糖病模型的筛选 将建立的糖尿病模型小鼠饲养3天后，筛选出长期维持在高血糖水平的小鼠。 血糖测定：采用 One Toutch II血糖仪测定。口服葡萄糖试验（OGTT）：饥饿5小时后，经口灌入50%的葡萄糖溶液，剂量2.5 g/kg［5］。观察0～4小时小鼠血糖变化，筛选出10只血糖维持在较高水平的长期高血糖病小鼠。 　　1.1.5 实验分组 正常对照组：正常健康昆明白小鼠，不加任何处理因素；糖尿病组：在注射Alloxan后经口灌入生理盐水，剂量1ml/只，2次/天，共15天。 　　1.2 组织线粒体的提取及膜蛋白定量［6］ 　　用快速双缩脲法测定，用280nm下校正的BSA作标准。本法测定蛋白浓度在0.05～1.25mg/ml，室温下测定。 　　1.3 线粒体指标的测定 　　1.3.1 线粒体呼吸链电子传递与质子泵出比值（H+/2e）的测定［6］ 依据文献［13］，采用铁氰化钾脉冲法测定。 　　1.3.2 线粒体丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量、谷胱甘肽（Glut