分子生物学实验教学教.docVIP

河南科技大学 实验教学教案 课程名称 分子生物学 指导教师 李市场 河南科技大学实验教学教案首页 实验名称 实验一、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验学时 4 每次实验组数 6 每组人数 5 实验类型 综合性 实验目的和要求： 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。 实验设备及器材： 控温摇床(37℃)，高速冷冻离心机，水浴锅，冰箱（-20℃,‐70℃） 超净工作台，培养箱(37℃)，752分光光度计，灭菌锅等。 实验原理： 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导人细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过中获得的新的表型（如Ampr等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择培养基上。 实验内容： 将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。将已经转化的细胞在选择培养基上进行筛选①无菌操作 ②低温操作 实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 实验目的 通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。 实验原理 将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。DH5α菌株的OD600 为0.5时,细胞密度在5×107 个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。2. 质粒的质量和浓度: 1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染。 　　本实验以E.coli DH5a菌株为受体细胞,并用CaCl2处理,使其处于感受态,然后与p质粒共保温,实现转化。由于p质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入p，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了p。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。 -20℃,‐70℃） 超净工作台 培养箱(37℃) 752分光光度计 灭菌锅 试剂 CaCl2 无菌水,冰 胰蛋白胨 酵母粉 Amp NaCl 其他用品 移液器， 枪头 1.5ml ,50ml 离心管 三角瓶 500ml 200ml 6cm平皿 试剂瓶60ml 量筒 烧杯 琼脂 甘油 酒精灯 三角玻棒 酒精棉球 火柴 ［溶液配制］ 0.1 mol/L CaCl2溶液 配置 灭菌 LB液体培养基 氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成50_60 mg/mL溶液，抽虑灭菌置－20℃冰箱中保存。 材料 E.coli.DH5α 质粒 DNA 五: 实验步骤：(CaCl2) （20人一班，分三组） 第一天：从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中,37℃振荡培过夜。 第二天： 取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养 2－3