响精典课件应面法优化香菇多糖发酵培养基.pptVIP

主要内容 1.香菇多糖与提取方法简介 2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法 3.实验材料与方法 4. Plackett-Burman优化培养基实验设计 5.响应面法优化培养基组成 6.结论 1.香菇多糖与提取方法简介 香菇多糖：是一种生理活性物质。它具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。 提取方法：从香菇子实体或经深层发酵后的发酵液中提取。香菇子实体生长周期长，产量和多糖得率均较低。而深层发酵培养香菇菌丝体不仅发酵液中含有与子实体相当或更高的营养物质，同时还可利用农副产品作原料，成本低，周期短，易于大规模生产，因此已得到广泛应用于重视。 但目前香菇菌丝体发酵水平较低，通过优化条件以提高多糖含量是发酵过程中急需解决的问题。 2.Plackett-Burman设计法与响应面分析法 同： 都是20世纪中叶后发展起来的的优化实验条件的统计学方法。能用较少的实验次数推算出目标值的优化条件，优化效率高。 异： Plackett-Burman试验就是筛选实验设计，主要针对因子数较多，且未确定众因子相对于相应变量的显著性，采用的试验方法。 响应面分析法是一种优化实验条件寻优的方法，它通过试验设计、建模、检验模型的合适性，寻求最佳组合条件的众多试验和统计技术。 3.实验材料与方法 3.1菌种来源：香菇135，本实验室分离保存（浙江庆元） 3.2试剂：马铃薯购自农贸市场，鱼粉为浙江工业大学药学院提供，其余所需的主要试剂均为分析纯， 3.3培养基与培养方法 斜面培养基：采用PDA 培养基。种子培养基组成为（%）：葡萄糖2，蛋白胨0.25，酵母膏0.25，初始pH 自然，121℃灭菌30min。初始发酵培养基成分为（%）：葡萄糖1.5，酵母膏0.5，MgSO4·7H2O0.1。初始pH 5.5，121℃灭菌30min。 斜面菌种转接至装有100mL 种子培养基的250mL 三角瓶中，置回转式摇床180r/min，25℃培养5d。然后将菌丝体无菌条件下打散制成种子悬液，以10%的接种量转接入100mL/250mL的发酵培养基中，回转式摇床180r/min，25℃培养6d 后结束。 3.4粗多糖提取 将发酵菌悬液离心（4,000r/min，20min），分别收集上清液和菌体。上清液中加入无水乙醇至75%（v/v），冰箱保存过夜，再经离心（8,000r/min，10min），取沉淀用于胞外多糖测定。菌体洗涤后，悬浮于一定体积的去离子水中， 超声波破壁（300Hz，10min)，高速离心（10,000r/min，10min）收集上清液，处理过程同上，用于胞内多糖测定。粗多糖为胞内多糖与胞外多糖之和。 1.5 粗多糖测定 粗多糖含量测定采用苯酚-硫酸法（Dubois et al.1956） 4. Plackett-Burman优化培养基实验设计 4.1 Plackett-Burman实验筛选主要影响因子 本实验选用N=12的Plackett-Burman实验设计，对葡萄糖（A）、鱼粉（B）、VB1（C）、NaCl（D）、FeSO4（E）、MgSO4（F）、KH2PO4（G）和初始pH（H）8个因素进行考察，每个因素取高（+）低（-）两个水平，高水平约为低水平的1.25倍，响应值为总粗多糖产量（Y），实验设计见表1，因素水平取值、效应及显著性分析见表2。 4.2 最陡爬坡实验设计及结果 要得到响应面拟合方程，必须要先逼近最佳值区域。而本方法以实验值的变化方向为爬坡方向，根据各因素效应值大小确定变化步长。根据表2分析结果，确定不显著因素的水平，表现为负效应的因素取低值水平，正效应的取高值。显著因素的变化步长及方向的实验设计及结果表明（表3），第3组产量最高，因此以第3组的水平作为响应面实验的中心点，即葡萄糖2%，鱼粉1.0%， KH2PO40.1%。 5.响应面法优化培养基组成 5.1Box-Benhnken实验设计与分析： 依据Plackett-Burman实验和最陡爬坡法实验确定的因素与水平。采用Box-Benhnken实验设计对产多糖发酵培养基进行3因素3水平的响应面分析实验。 5.2二次回归模型拟合和方差分析 利用系统软件SAS8.0对表5实验数据进行二次多项回归拟合，通过RESEG（响应面回归）过程进行数据分析，建立二次响应面回归模型，并寻求最优相应因子水平，得到回归方程： Y=2.136667+0.44625X1+0.045X2-0.01375X3-0.44583X12-0.13833X