药物的体外抗菌试验 第十九.docVIP

第十九章 药物的体外抗菌试验 教学要求 .（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。 .（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。 .（三）了解体外抗菌试验的影响因素。 第一节 常用的体外抑菌试验 一、药物的体外抗菌试验 .又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。 .最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。 .优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。 .缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。试验菌 .细菌、霉菌和酵母菌常用 .标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。 .临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。控制培养时间。 .接种菌量的多少的计算 培养基 .根据试验菌的营养要求进行选择 .培养基质量控制 供试药物 .药物的浓度和总量要精确配制 .供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。 .中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度 对照试验 .试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长 .已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。 .溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用 （一）连续稀释法 .方法：液体法和固体法。 .用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。 .抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长 .杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。 1、液体培养基稀释法 .方法：两倍稀释法 .步骤： 液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每 管加入一定量试验菌 24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。 液体稀释法图解 抗菌药物的浓度增加最低抑菌浓度移种平板 最低杀菌浓度 图 20-1液体培养基连续稀释法 .优点：能与药物充分接触，结果更具有精确性和可重复性。 .缺点：药液和培养基的混合物若不澄清，无法直接观察结果，需进一步试验才能确定MIC值。 杀菌曲线 .选择适当的药物浓度，取适量于无菌试管中 ，加入试验菌液，使各试管菌浓度约为 105CFU/ml。 .一定间隔时间内将试验管充分混合后取样并稀释，用平板法进行活菌计数，绘制活菌数的对数-时间曲线。 2、固体培养基稀释法 .（1）平板法 .方法：系列浓度的药物混入琼脂平板，用微量加样 器或多点接种仪接种试验菌。 .用途：用于各种药物的抗菌活性测定及新抗菌药物 的筛选。特别适合于非酵母样的真菌药敏试验及颜 色深、澄明度差的样品的抗菌作用测定。 .优点：在一组平板中测定多种试验菌的 MIC，不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。 .缺点：不易进行再培养而确定MBC。 .（2）斜面法 .方法：不同浓度的药物混入培养基中制成斜面，于斜面上接种一定量的试验菌，观察其 MIC值。 .用途：用于需长时间培养的试验菌（如TB）或避免孢子飞扬污染环境的霉菌。 .优点：不受药物颜色及浑浊度的影响；容易发现污染菌。 .缺点：不易进行再培养而确定MBC。 （二）琼脂扩散法 .定性试验 .基本方法：利用药物可以在琼脂培养基中扩散的原理，将试验菌加入琼脂培养基，混合倾注平板或用L棒使试验菌均匀分布，然后加药于含菌平板，培养18-24小时后，根据抑菌圈或抑菌范围大小初步判断抑菌作用的强弱。 .用于细菌和酵母菌的药敏试验 1、滤纸片法 含药物的滤纸片含菌平板抑菌圈37℃培养 K-B法 .基本原理：滤纸片法，但需用统一的培养 基、菌液浓度、纸片质量、纸片含药量以 及其他试验条件。 .结果判断：卡尺精确量取，根据抑菌圈的直径大小判断该菌对该药物是抗药、中等敏感或敏感。 .打孔并注入药液代替滤纸片含菌平板药液 3、管碟法 .小管（玻璃管、铝管、钢管）放于含菌平 板上，小管内加入药液，根据抑菌圈直径 判断抗菌效力。含菌平板小管药液 4、挖沟法 .于无菌平板上挖沟取出琼脂条，沟内加入药液，然后在沟两旁接种几种试验菌。 .适用于一药多菌的测定。 ABC 1 2 3 4 5 药液细菌菌苔 接种的细菌 琼脂扩散