发酵实验二、根霉曲糖化能力的测定选读.docVIP

发酵工程学实验报告 实验二 根霉曲糖化能力的测定 学 院　　生命科学学院　　　　 专 业　　应用生物教育　　　　　 班 级　　12应生A班　　　 　　 姓　　名　　李顺昌 　　　　　　 学　　号　　124120218　　　　　　 实验课程　　根霉曲的制备 指导教师　　许 波　　　　　　　　 开课学期　　2014—2015学年下学期 实验二 根霉曲糖化能力的测定 小组合作：是 小组成员：李顺昌、李媛媛、方淑萍、周玉坤 实验目的 1.了解标准曲线的制作和使用方法 2.掌握DNS（3,5-二硝基水杨酸）法测定糖化酶活力的基本原理和方法 3.学会计算糖化酶的糖化DE 二、实验设备与材料 1.设备：天平、烧杯、三角瓶、水浴锅、离心机、722分光光度计等 2.材料：根霉曲、柠檬酸缓冲液、DNS、0.1%葡萄糖溶液、1%淀粉溶液 三、实验原理 1.淀粉：由葡萄糖通过α-1,4糖苷键构成的直链淀粉和α-1,6位有分支的支链淀粉组成，其水解需淀粉酶和糖化酶的作用； 淀粉酶的作用：首先酶解淀粉为小分子的糊精、寡糖和少量单糖； 糖化酶的作用：其次通过糖化酶的作用将小分子的糊精和寡糖降解为还原性的单糖。 2.DNS法：利用碱性条件下，二硝基水杨酸（DNS）与还原糖发生氧化还原反应，生成3-氨基-5-硝基水杨酸，该产物在煮沸条件下显棕红色，且在一定浓度范围内颜色深浅与还原糖含量成比例关系的原理，用比色法测定还原糖含量的。 3.DE（Dextrose Equivalent，葡萄糖值）：是糖化液中还原糖（以葡萄糖计）占干物质的百分比，工业上用DE值表示淀粉的水解程度或糖化程度。 四、实验方法步骤 1.绘制标准曲线的方法 先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定吸光度A。 以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。 然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量。 2.待测酶液的制备 烘干：把发酵产物倒于平皿中，50℃烘干； 制备酶粉：将烘干的发酵产物用研钵研磨成粉状（尽量磨细），装于塑料袋中备用； 制备酶液：称取1g根霉曲粉，充分溶解于30mL缓冲液(即稀释30倍)，纱布（4层）过滤去除杂质，滤液备用。 糖化酶酶活测定方法 酶活定义：在50℃、pH4.8条件下，每分钟内每毫升酶液降解淀粉底物产生1μmoL葡萄糖所需要的酶量定义为一个国际单位（IU）。 酶活计算公式：酶活(IU)=(K×OD+b) ×N ×1000/180.2/0.2/10 K: 标准曲线的斜率；N：稀释倍数；1000：转换因子1mg=1000μg 180.2：葡萄糖分子量；0.2：酶液体积；10：反应时间（min） 4.糖化DE值的计算 DE%=还原糖含量/淀粉含量×100 计算公式=(K×OD+b)*15/（1.8 ×1% ×1000) × 100 5.淀粉酶的液化效果检测 6.试验注意事项 试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落； 移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！ 精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理； 避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时。 五、实验报告 （一）实验现象、数据及结果 1.标准曲线测量结果 葡萄糖溶液体（ml） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 葡萄糖含量（mg） 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 缓冲液（ml） 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 DNS?(ml) 3 3 3 3 3 3 3 沸水浴煮沸5min 流水冷却,加蒸馏水10mL，混匀 定容总体积(ml) 15 15 15 15 15 15 15 OD（540nm） 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程y=0.9421x+0.0074，k=0.9421，R2=0.9673。式中Y表示测定的吸光度（OD）值，X表示葡萄糖的浓度。 2.糖化酶活力测定现象和结果 试管编号 C试管 A试管 B试管 OD（540nm） 0.00 0.182 0.179 3.酶活力单位计算 酶活(IU)=(K×（ODa+ODb）/2+b) ×N ×1000/180.2/0.2/10 =（0.9421×（0.182+0.179）/2+0.0074）×30×1000/180.2/0.2/10 =14.771 4