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荧光显微镜 荧光显微镜的优点和用途 什么是荧光 ? 物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。 即：物质吸收短波光，发射出的长波光。 一种光化荧光 荧光的种类 自发荧光：有些物质不加染色，也能发出荧光（自发荧光或原发荧光），但在医学和生物学领域中，只有很少物质具有自发荧光。 二次荧光（用化学染色） 非荧光性的物质（蛋白质、炭水化合物）用荧光色素染色，由荧光色素产生荧光（二次荧光），以便进行观察。对特定物体选择合适的荧光色素，该物体就能和周围的组织或细胞区别出来而可以观察到。 抗体荧光技术（用免疫染色） : 荧光的性质 荧光显微镜的种类 透射式 落射式 荧光显微镜的主要部件 透射式 汞灯光源 激发滤色镜 暗场聚光镜 吸收滤色镜 落射式 汞灯光源 激发滤色镜 分色镜 吸收滤色镜 透射荧光显微镜的构造 落射荧光显微镜的构造 落射荧光显微镜各部件特性和作用 落射荧光显微镜各部件特性和作用 落射荧光显微镜原理 透射荧光显微镜原理 滤色镜的选择 激发滤色镜的选择 激发滤色镜带宽对图象的影响 多重染色标本的多色观察 三色滤色镜的特性曲线 双重染色标本的单色和双色观察 单色滤色镜的特性曲线 双色滤色镜的特性曲线 现行荧光显微镜特点和各种滤色镜 Free Cube 早期荧光显微镜 早期荧光显微镜附件 早期荧光滤色镜特点 辅助激发和辅助吸收滤色镜的特性 辅助激发滤色镜的运用 辅助吸收滤色镜的运用 油镜应使用荧光油 物镜光栏的运用 荧光的衰减 防衰减的方法 使用抗衰减剂 选择衰减小的荧光素 降低激发光强度 降低标本中氧的浓度 使用抗衰减剂的效果 广泛应用的抗衰减剂 使用要点 标本制作 选用荧光物镜 正确选择滤色镜 调节光源中心 油镜应使用荧光油 光栏物镜应适当调节物镜光栏 适当调节孔径光栏和视场光栏 各种汞灯灯箱 汞灯中心调节方法 放置一张白纸于载物台上 转入B激发滤色镜 用10X物镜观察并聚焦白纸 取下10X物镜 通过汞灯箱上聚焦旋钮聚焦汞灯电极于白纸 通过汞灯箱上下、左右旋钮调汞灯电极中心于白纸上圆环中心 5、荧光显微镜的结构和普通显微镜有何区别？ 答：1）荧光显微镜要有一个能产生高能紫外线的光源。一般采用汞灯或氙灯作紫外光源，也有用溴钨灯的。（1分） 2）紫外光源因其功率较大(100w以上)尤其是汞灯和氙灯所需要的电压离达上千伏，一般都专门设一个电源箱来供电。（1分） 3）从光源灯到标本之间，紫外线所经过的所有光学元件，均需使用对紫外线通透性能好的材料如石英制成。普通的光学玻璃不能透过320nm以下的紫外线。（1.5分） 4）在光源与标本之间需要设置激发滤光片，用以选出照射标本所用的激发光。在标本和目镜之间设有荧光(或曰发射)滤光片。该滤光片只让荧光通过，而隔断紫外线(紫外线对眼睛有伤害)。激发和荧光滤光片可以各有多块，以便满足不同的需要。（1.5分） DAPI+FITC+Texas Red --选用特制的多色滤色镜 激发 分色 吸收 NUA WIB DUAL BAND (特制） WIBA WIG WIB DAPI+FITC FITC+PI ---选用单色和双色滤色镜 ● 激发/分色/吸收一体化 --- CUBE ● 同时安装4组或6组CUBE(另可提供8组型) ● 数十种通用和专用CUBE供选择 吸收滤色镜 激发滤色镜 分色镜 根据需要随意选择各种波长滤色镜 有很多辅助滤色镜 宽带激发 激发 分色 吸收 荧光 辅助吸收 杂光 nm T% 光栏全开启 光栏适当关小 物镜光栏 适当调节物镜光栏以获得最佳效果 有衰减的标本 * Fluorescence microscopy Mainly fluorescence detector systems are color-blind! (Colors are based on a [pseudo-]color look-up table) 优点： 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色 用途： 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析 Basic idea of fluorescence microscopy: Stokes shift E = hn c = ln E ~ 1 / l .自发荧光（不加染色） ; .二次荧光（用化学染色） ; .抗体荧光技术（用免疫染色）; 激发光 发射光 利用特定的抗原必然和特定的抗体相结合这一个事实，有意识地使带荧光标记的抗体和标本中的