许丽参考珍104120236.docVIP

本科学生实验报告 姓名＿许丽珍104120236 学院 生命科学学院＿＿＿ 专业＿应用生物教育＿ 班级＿10级A班＿＿ 实验课程名称＿植物生理学＿ ＿ 指导教师及职称 樊冬梅＿＿＿＿＿ 开课时间 2012 至 2013 学年＿一 学期 实验名称：光合色素的提取、理化性质、分离、吸收光谱及含量的测定 实验时间：2012.10.8 –2012.10.8 小组合作：许丽珍和许瑞琼 一、实验预习： 实验目的 ： （1）掌握光合色素的提取方法以及了解有关的理化性质。 （2）掌握光合色素的分离方法以及了解有关的吸收光谱。 （3）掌握用分光光度计测定叶绿素含量的方法。 实验设备及材料： 实验材料及药品:菠菜叶片、CaCO3﹑石英砂﹑丙酮﹑20%KOH甲醇溶液﹑苯﹑50%醋酸﹑醋酸铜粉末﹑四氯化碳﹑80%苯丙。 实验用具:研钵、试管、滤纸﹑三角瓶﹑天平﹑滤纸条﹑分光光度计﹑离心机﹑离心管﹑A4纸﹑吸管。 （4）皂化反应：取一支试管，加入色素提取液2.5ml，再加入20%KOH甲醇溶液1ml，摇匀，再加入苯2.5ml，轻轻摇动，沿试管壁慢慢加入自来水1ml，轻轻摇动后观察，注意观察整个过程颜色的变化。 （5）取代反应：取一支试管，加入3ml色素，逐滴加入50%醋酸直至溶液变为黄褐色。倒出一半，加入少许醋酸铜粉末，酒精灯上加热，与另一半比较颜色的差异。 （6）吸收光谱的变化：皂化和取代反应后的色素进行吸收光谱分析 （7）光合色素分离： 剪取适当长度和宽度的滤纸条→ 用上行纸层析法分离色素→ 启动剂：四氯化碳。 （8）吸收光谱的测定：光合色素的吸收光谱：取色素溶液1 mL，加入丙酮3 mL，摇匀后在分光光度计上400到700 nm处每隔10 nm进行扫描。 （10）各色素的吸收光谱：上述层析出的3~4种色素，分别剪下后溶于3 mL丙酮中，按上述方法扫描 （11）光合色素含量的测定 方法一：快速测定法 由于叶绿素a、b在652nm处有共同吸收，k = 34.5 L g-1. cm-1。可直接用便携式叶绿素测定仪测定植物叶片的叶绿素含量，最后浓度单位为mg/dm2 方法二: 分光光度计法 ①色素提取：将上述植物叶片洗净并用滤纸吸干，准确称取已知Φ的叶圆片0.05g左右，加入少许CaCO3和石英砂及80%丙酮2ml，充分研磨，转入离心管中（离心机使用），再用5ml 80%丙酮洗研钵，转入离心管中，平衡，5000rpm离心10min，上清液定容至10ml备用。 ②测定：以1cm比色皿分别测定A663、A645。使A控制在0.1 ~ 0.8之间。 （二）注意事项： （1）在观察荧光现象时试管的液体要要与光线垂直的方向观察色素的颜色。 （2）在研磨时不宜加入过多的CaCO3和石英砂，研磨时间不宜过长，以免破坏叶绿体。 （3）在色素分离中，滤纸条的长度和宽度适度，过长会侵入到缓冲液中，过宽会触到水管内壁。 （4）在皂化反应中只能用20%KOH甲醇溶液，而不能用20%KOH水溶液.色素只溶于具有极性有机溶剂. 二、实验内容 1实验现象数据及观察结果 色素分层及皂化反应和取代反应 光合色素含量测定 实验数据及计算 三类色素浓度: =0.862 =0.418A 由公式: =9.822mg/L =5.538mg/L 各叶绿素含量： V=10ml W=0.05g 由公式： 叶片面积： GSM=70-105 W=0.47g 由公式： 叶面积=0.0067—0.0045（m2） 观察结果： 可以观察到荧光现象，因为在提取液中无任何的电子受体，因此可以观察到荧光现象。 皂化反应后的颜色分为三层.上层的颜色为黄色，中间层的颜色为绿色，下层的为墨绿色. 在取代反应后的颜色为黄褐色。 对实验现象、数据及观察结果的分析与讨论： （1） 之所以发生荧光现象，叶绿体色素在透射光呈绿色，在反射光下呈紫色，这是由于叶绿体色素主要吸收自然光汇中的红橙光和蓝紫光，未被吸收的光线透射过叶绿体色素溶液，呈现出绿色；在可见光下，叶绿体色素受激发，再从激发态跃迁到基态的过程中发出荧光，故反射光为深紫色。 （2）在向2-3ml叶绿体色素溶叶中加20%KOH甲醇溶液后，溶液立即转化为黄褐色，稍微有点浑浊，不断震荡 3min 后溶液变澄清，颜色 呈深黄绿色。对于这