分子生物学技术实验- 图文.pptVIP

* 质粒DNA的分离 基本步骤： 培养细菌使质粒扩增 收集和裂解细胞 分离和纯化质粒DNA * 碱裂解法 基本原理： 当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不复性而呈絮状，离心时可沉淀下来。 * 主要试剂： 溶液Ⅰ：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris.Cl (pH8.0)， 10mmol/L EDTA (pH8.0)。 溶液Ⅰ可成批配制,每瓶100ml,高压灭菌15分钟,储存于4℃冰箱。 溶液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH (临用前用10mol/L NaOH母液稀释)，1％ SDS。 溶液Ⅲ：5 mol/L KAc 60ml，冰醋酸 11.5ml， H2O 28.5ml，定容至100ml, 并高压灭菌。溶液终浓度为: K+ 3mol/L, Acˉ 5mol/L。  * 质粒DNA小量提取步骤： 1．收获 1）在含相应抗生素（Amp）的LB中接入一单菌落，于37℃剧烈振摇下培养过夜。 2）将1.5ml培养物倒入Ep管中，室温 8000rpm离心30s，将剩余的培养物贮存于4℃。 3）吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。 * 2．碱裂解 4）将细菌沉淀，所得重悬于100μl用冰预冷的溶液Ｉ(GTE缓冲液）中，旋涡振荡