、胶乳偶联方案的输出.docVIP

方案一 实验方法：一步法共价结合 实验步骤： 配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0； 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L； 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）； 将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合，混合后在温室培育20分钟； 用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10mg/mL（52μmol/mL）； 取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中； 用0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH值至6.5±0.2，在摇床温室培育2小时； 将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。 方案二 实验方法：简单二步法共价结合 实验步骤： 配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0； 将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L； 用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）； 1mL胶乳微球悬浮液，加入20mgEDAC，在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20mg/mL； 用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理； 将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/mL； 再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3小时； 按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟； 除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中 方案三 实验方法：生成NHS-酯的中间体二步法共价结合 实验步骤： 每ml反应混合物加入下列各物： 去离子水是最后容积为1.0mL； 0.1mL的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5M MES缓冲溶液）；胶乳微球最终浓度为1%（W/V）； 0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液； 19.2mg/mL（100mM）的EDAC在去离子水中的溶液 在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌； 用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC； 重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）； 将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中，浓度为1mg/mL； 立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%（w/v）、0.5mg/mL、25-50mM）； 将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌； 按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟； 除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液中。 附录 试剂： MES缓冲液 500mM 和 50mM；PH6.1；4°C 储存（如果发黄或者污染，应倒掉） 。 EDAC 盐酸 1－乙基－3－二甲基氨基丙基二酰亚胺 ；52umol/ml：分析天平称取 10mg EDAC，加入 1ml 去离子水。 （EDAC 对潮气非常敏感，在水中快速水解，EDAC 储存于干燥器中，-5 °C 保存。 ） NHS N－羟基琥珀酰亚胺 ；50mg/ml 水溶液 蛋白质溶液 蛋白质充分稀释溶解，浓度为 1－10mg/ml 技术说明 ： 1．微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变； 单位质量的微球表面积（m2/g） ： A/M = 6/PD 其中 D= 微球粒径（μm） 　 P = 微球密度 (聚苯乙烯 1.05g/ml) 例如：0.8μm的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.05×0.8 = 7.14 m2/g 1.6μm 的聚苯乙烯微球，A/M = 6/1.05×1.6 = 3.57 m2/g 0.8μL ，10mg 聚苯乙烯微球需加入 125－250μL 多克隆抗体 1.6μL ，10mg 聚苯乙烯微球需加入 62.5－125μL 多克隆抗体 2．虽然疏水性吸附与缓冲液 pH值无关，但反应缓冲液的 pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点 pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用； 3．高效搅拌下，将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液，可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度； 4．绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。 方案五 Sample Protocol for Two-Step Carbodiimide Coupling of Protein to Carboxylated Microspheres Microspheres should be protected fr