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Journal of Chromatography A, 1003 (2003) 211~216 生物胺的胶束毛细管电泳-化学发光实时检测 刘彦明，程介克 武汉大学化学学院，中国，武汉，430072 收稿2003.3.25接收2003.4.10 ·10-8、3.5·10-8、3.9·10-8和1.2·10-7。这种方法被用来分析湖水中的生物胺。 ◎2003年Elsevier B.V.保留所有权利。 关键词：检测、电泳、化学发光检测、生物胺 1.前言 生物胺在不同的生物体中自然合成。它们是微生物新陈代谢和活动的产物[1]。我们可以在细胞液、环境标本和工业流水线找到生物胺并常常检测它们的水平。胺类物质来自生物活动的排泄物。在食品分析中，多胺类尤其是腐胺和尸胺是被广泛应用的因素。气相色谱分析[2,3]，薄层色谱分析[4,5]和高效液相色谱分析(HPLC)方法[5-11]经常用来检测生物胺，而且HPLC是应用最广泛的。毛细管电泳(CE)已经被证明是一种强大的分离技术。近来，CE已经被成功用于分离胺类物质。至今为止，很多种检测方法，如荧光分析[1,12-18]、紫外-可见分光光度法[19-24]和电导分析[25,26]，都已经应用到毛细管电泳的检测。化学发光(CL)检测是一种高灵敏度且造价低廉和构造简单的光学系统，被证明可应用于传统的毛细管电泳[27-32]和微芯片[33,34]。Dadoo等人已经实现利用毛细管电泳-化学发光检测N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(ABEI)衍生的精氨酸和甘氨酸[35]。近期，Liu等人完成利用毛细管电泳-氯化三(2,2-联吡啶)钌(Ⅱ)电化学发光检测苯海拉明的研究[36]。 在这项研究中，我们报道了利用ABEI标记生物胺(例如：1,3-丙二胺、1,4-丁二胺、1,5-戊二胺和1,6-己二胺)的胶束毛细管电泳-化学发光实时检测方法。已优化影响分离过程和化学发光检测的各个参数。这种方法被计划用来分析湖水中的生物胺。 2.实验方法 2.1.试剂和溶液 ABEI和丙二胺(Fluka，瑞士布克斯威斯康辛州密尔沃基美国密苏里州圣路易斯市堪萨斯州堪萨斯μm微膜过滤。进样溶液ABEI和DSC分别溶解在甲醇和乙腈中。胺类用甲醇溶解并稀释到所需的浓度。 2.2.仪器 CE-CL仪器为实验室自制。0~30 kV毛细管电泳高压电源(北京大学，中国)。内径50 μm×外径375 μm分离毛细管(永年光学光纤厂，中国河北)。把毛细管尾部5 cm的涂层灼烧掉并用氢氟酸腐蚀2.5 h使外径大约为200 μm。(先用石蜡密封毛细管的尖端以防止内壁的腐蚀)。氢氟酸处理完后将分离毛细管插入内径530 μm的反应毛细管。将这两个毛细管固定在四路树脂玻璃连通器。柱后试剂(铁氰化钾和氢氧化钠混合溶液)在一个内径320 μm的毛细管内通过重力作用加入。试剂毛细管的排放孔也通向四路连通器。用树脂玻璃做的螺母和聚酰亚胺的金属箍来安装上文提到的四路连通器里的三个毛细管。接地的电极也被放到连通器里去完成毛细管电泳的通路。反应毛细管的出口比其它毛细管缩进2 cm，使溶液更快更方便地流出反应毛细管。烧尽反应毛细管1 cm的聚酰胺涂层以形成检测池。化学发光信号用型号为R298光电倍增管(PMT，滨松光子学株式会社μL的ABEI-DSC混合溶液中。旋转搅拌混合后置于室温2 h。必要时可将衍生的胺类溶液稀释于5 mmol/L硼酸盐缓冲溶液中(pH 8.5)。已研究ABEI-DSC溶液的摩尔浓度影响胺类的因素。ABEI-DSC溶液对胺类的最适摩尔浓度为10 mmol/L已被找出。 新的毛细管的清洗顺序是2 mol/L NaOH-CH3OH，1 mol/L NaOH，1 mol/L HCl，水30 min，再用运行缓冲溶液平衡30 min。运行缓冲液加入过氧化氢。当四路连通器和反应毛细管先充满柱后试剂时，分离毛细管再充满运行缓冲液。在每次运行结束后，分离毛细管必须用运行缓冲液处理3~5 min。进样高度差要达到10 cm。 3.结果与讨论 3.1.分离方法的选择 仅仅利用毛细管区带电泳固有的特性分离丙二胺，腐胺，尸胺和己二胺看起来是很困难的。实验结果显示，四种胺类不可以用硼酸盐缓冲体系的毛细管区带电泳分离。添加SDS可以有效的改善分离度和峰形。添加SDS使MEKC可以更好的分离结构相似且复杂的溶质[37]。发现SDS最适宜的浓度为80 mmol/L。然而更高浓度的SDS会导致更长的迁移时间和更大的电流。四种胺的SDS浓度对迁移时间的影响如图1。 图1 SDS浓度对迁移时间的影响。条件：电泳缓冲液：10 mmol/L四硼酸钠+100 mmol/L H2O2+80 mmol/L SDS(pH 9.3)；柱后CL试剂：3 mmol/L K3Fe(CN)