RNAi及其在抗HIV中的初步应解析.pptVIP

* 在组织培养的Schneider-2细胞可发现miR12,但是检测不到miR3~miR6的存在.miR171在拟南芥的花序和花组织中高表达,而在茎和叶组织中却没有表达的迹象.miRNA在不同的细胞和组织中表达,显示了它们在控制个体发育中的特定功能 mir3~mir7基因只在果蝇胚胎形成时表达,而miR1,miR12的含量在果蝇幼虫阶段急剧上升并在成虫期维持较高水平,同时,在所有阶段都存在的miR9和miR11的含量却急剧减少 * RNAi技术较传统的转染实验简单、快速、重复性好，克服了转染实验中重组蛋白特异性聚集和转染效率不高的缺点， 因此认为RNAi技术将可能成为研究细胞信号传导通路的新途径 ?比较项目 化学合成 体外转录 RNase III降解dsRNA siRNA表达载体 PCR表达框 转染的相对难易程度 好 好 好 差 差 可筛选性 (例如抗生素筛选) ?不可以 不可以 不可以 可以 不可以 能否用于长效抑制 不可以 不可以 不可以 可以（抗生素筛选） 不可以 能否大规模制备 可以 有限 有限 可以 有限 检测总体转染效率 不可以 不可以 不可以 可以 不可以 每个基因的相对费用（不包含人力） 高 中等 低 中等 中等 ?比较项目 化学合成 体外转录 RNase III降解dsRNA siRNA表达载体 PCR表达框 转染的相对难易程度 好 好 好 差 差 可筛选性 (例如抗生素筛选) ?不可以 不可以 不可以 可以 不可以 能否用于长效抑制 不可以 不可以 不可以 可以（抗生素筛选） 不可以 能否大规模制备 可以 有限 有限 可以 有限 检测总体转染效率 不可以 不可以 不可以 可以 不可以 每个基因的相对费用（不包含人力） 高 中等 低 中等 中等 SiRNA的转染 1.磷酸钙共沉淀 将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。 SiRNA的转染 2.电穿孔法 电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。 SiRNA的转染 3.DEAE-葡聚糖和polybrene 带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA可以结合在细胞表面。通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。 两种试剂都已成功用于转染。DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。 SiRNA的转染 4.机械法 转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particle）。显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。 SiRNA的转染 5.阳离子脂质体试剂 在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。 使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。 据称，一个约5kb的质粒会结合2-4个脂质体。被俘获的DNA就会被导入培养的细胞。 转染实验中，需要注意问题 1.纯化siRNA 在转染前要确认siRNA的大小和纯度。为得到高纯度的siRNA，推荐用玻璃纤维结合，洗脱或通过15-20%丙烯酰胺胶除去反应中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和盐离子。注意：化学合成的RNA通常需要跑胶电泳纯化（即PAGE胶纯化）。 转染实验中，需要注意问题 2.避免RNA酶污染 微量的RNA酶将导致siRNA实验失败。由于实验环境中RNA酶普遍存在，如皮肤，头发，所有徒手接触过的物品或暴露在空气中的物品等，此保证实验每个步骤不受RNA酶污染非常重要。 转染实