第6章克隆策略分解.ppt

抗药性标记选择(插入失活法) (3)显色反应选择法(α-互补法) 将含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷/5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-硫代半乳糖苷)的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为α-互补。 α 互补的检测 或?-半乳糖苷酶法 PCR筛选法 利用合适的引物，以从初选出来的阳性克隆中提出的质粒为模板进行PCR，通过对PCR产物的电泳分析，确定目的基因是否插入到载体中。 3 菌落原位杂交法 （colony in situ hybridization） ●1975年，M.Grunstein和D.Hosnese根据检测重组子DNA分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，提出了菌落原位杂交技术。 4 免疫筛选法 放射性抗体检测法 滤膜（固定抗体） + 免疫沉淀检测法 菌落 沉淀素 二、基因文库的鉴定 限制性核酸内切酶分析 当载体与外源基因进行连接时，都需要对其进行酶切，而且这些内切酶都是已知的，因此可以从初步筛选出来的阳性重组菌中提取质粒DNA，然后用已知的内切酶进行酶切，酶切进行琼脂糖凝胶电泳，如果出现与预知的大小一致的电泳片段，就证明已经有目的基因插入到载体中。 凝胶电泳检测 加样孔 DNA Marker 空质粒 重组质粒 重组质粒酶切 PCR扩增片段 表达质粒pXETA1酶切电泳结果1.λDNA/EcoRI+HindⅢMarkers；2.pET-28b(+)/BamHI+HindⅢ；3.pKMA100/BamHⅠ+HindⅢ； 4.pXETA1/BamHⅠ+HindⅢ；5.pXETA1； 6.pXETA1 plasmid. ?毒素基因  2 Southern Blotting 这种方法是E.M.Southern于1975年建立的，它是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法，经常用于对原位杂交所得到的阳性克隆进一步分析，这种方法包括两部分内容： ①将DNA的限制性核酸内切酶的酶切片段从琼脂糖凝胶上转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上； ②用各种标记的DNA探针同固定在膜上的DNA片段杂交，经放射自显影或其它显色方法确定出与探针互补的电泳带。 3 DNA序列测定法 本章重点掌握的内容 目的基因的概念 基因文库的概念及构建基因文库的基本程序 基因组文库的概念及操作步骤 cDNA文库的概念及操作步骤 基因组DNA文库与cDNA文库的优缺点 2、基因组文库的筛选 表型筛选法：表达性状易于鉴别，如互补筛选 抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲苄 二氨嘧啶降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长 分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选 免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选 PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段 第二节 cDNA文库构建 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，仅有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。可见，由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。 一、cDNA基因文库构建的步骤 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 第一条cDNA合成 第二条cDNA合成 双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖 cDNA文库的构建： 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 1 细胞总RNA的提取和mRNA的分离 通常用于构建cDNA的是真核细胞的mRNA，由于cDNA从mRNA合成而来，代表了基因组的可转录部分，不含内含子序列，因此可被用于在大肠杆菌中表达编码蛋白。 由于每类细胞和组织只表达一套特定的基因，因此从特定组织中制备的mRNA通常会富集某些特异序列。所以起始材料的选择十分重要。 1、mRNA的制备: 动物细胞或植物细胞mRNA的制备 2、mRNA的来源: 选用mRNA含量高的组织材料，或通过药物等方法提高mRNA的含量。 3、mRNA完整性的检测 1)mRNA分子的大小： 哺乳动