第7章+蛋白质分离纯化与表征分解.ppt

蛋白质分离纯化是利用其特性的差异 分子的大小和形状 酸碱性质 溶解度 吸附性质 对配体分子的特异生物学亲和力 蛋白质含有酸/碱AA残基具有两性 碱/酸越大——pI 越大 pI通常在 6.0 左右 蛋白质的分子量 一般在一万至一百万道尔顿之间 1道尔顿＝1×C12绝对质量/12 ≈1.66×10-27千克 测定蛋白质相对分子质量的原理和方法 （一） 根据化学组成测定最低相对分子质量 （二） 渗透压法测定相对分子质量 （三） 蛋白质的扩散和扩散系数 （四） 沉降分析法测定相对分子质量 （五） 凝胶过滤法测定相对分子质量 （六） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量 （一）根据化学组成测定最小分子量 （五）凝胶过滤法测定相对分子质量 （六）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定相对分子质量 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 （二）蛋白质的沉淀 Pr从胶体溶液中析出 任何破坏稳定蛋白质溶液的因素都可能使蛋白质沉淀 I 可逆沉淀 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 Pr结构和性质没有变化 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等 不可逆沉淀 强烈沉淀条件 破坏Pr胶体溶液稳定性 也破坏Pr结构和性质 沉淀不能再重新溶解 ——变性沉淀 如加热沉淀、强酸/碱沉淀、重金属盐 和生物碱沉淀等 盐溶—盐析 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀溶解—盐溶 原因？ 盐析 向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出 原因？ 五、蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 1、透析和超过滤 2、密度梯度（区带）离心 （二）利用溶解度差别的纯化方法 1.等电点沉淀 调整溶液pH 不同蛋白在各自 pI处依次沉淀 2.盐溶和盐析 （三)根据电荷不同的分离方法 1.电泳 原理： 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 分子大小不同，电场中移动速度也不同 （四）利用蛋白质选择性吸附的性质 羟磷石灰层析 疏水作用层析 （五）利用对配体的特异生物学 亲和力的纯化方法 六、蛋白质含量测定和纯度鉴定 平板电泳 等电聚焦电泳 双向电泳 离子交换层析 亲和色谱颗粒 具有极强的专一性 扬州大学生物科学与技术学院 生物化学精品课程 扬州大学生物科学与技术学院 第7章 蛋白质的分离纯化和表征 蛋白质纯化应根据研究工作和生产的具体目的和要求，制订分离纯化的合理程序。 一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状 1、测定蛋白质中某一微量元素的含量 2、假设蛋白质中仅含一个铁原子 最低相对分子质量= 100* 55.8/铁的百分含量 例如肌红蛋白含铁量为0.335%，那么其最低相对分子质量就是 55.8/0.335 × 100 = 16700 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不取决于分子的质量，而是它的斯托克半价。 如果某种蛋白质与一理想的非水化球体过柱速度相同，则认为具有与该球体相同的半径，称斯托克半径 蛋白质混合样 标准蛋白质（已知Mr和斯托克半径）和待测蛋白质必须具有相同的分子形状（接近球形） 蛋白质颗粒在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于： 所带电荷 分子量 分子形状 但是如果在该系统中添加SDS和少量巯基乙醇，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量。 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 变性 ？ 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 迁移率与电荷和形状无关，仅取决于相对分子质量 巯基乙醇破坏二硫键 蛋白质分子的形状 蛋白质分子在溶液中的形状或构象的信息，可借助其摩擦系数与理想球体的摩擦系数之比，也就是所谓的蛋白质分子的摩擦比来推测。 摩擦比越大，蛋白质分子的不对称性越高。 （一）胶体性质（colloidal system） 胶体溶液的特点： 分子直径在1-100 nm内 溶于水 不易聚集沉淀 大多数球状蛋白能形成稳定的亲水胶体溶液 蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.水膜弹性 3.质点的大小（1～100nm） 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质 Ⅱ 1.盐析法 加入大量中性盐（硫酸铵、硫酸钠和氯化钠）脱去蛋白质的水化层，盐析一般不引起变性 分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中 盐溶 蛋白质脱去水化层而聚集沉淀 盐析（（NH4）2SO4） 2.有机溶剂沉淀 脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用 3.等电点沉淀 蛋白质分子带有相同数量的