第二章 载体-1-1幻灯片.ppt

* 2）受体菌lacZ突变（lacZ?M15） 设计适用于蓝白斑筛选的基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。受体菌基因组的?-半乳糖苷酶基因的N端有缺失（缺失?肽），不能形成四聚体的活性酶，因此不能分解X-gal 而产生蓝色物质。 受体菌株：JM系列、TG1、TG2、XL1-blue、XS127、XS101、KK2186、MV1184、DH5a * pUC质粒载体具有一段称为LacZ’ 的基因，包括：一段β-半乳糖苷酶的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆位点(MCS)。 虽然上述缺陷菌株基因组无法单独编码有活性的β-半乳糖苷酶，但当菌体中含有带LacZ’的质粒后，质粒LacZ’基因编码的α肽链和缺陷菌株基因组表达的β-半乳糖苷酶突变体互补，使它能形成四聚体。又能分解Xgal，产生蓝色物质。 这种现象即α-互补。 3）载体lacZ’与?互补 * 4）?互补的插入失活 pUC载体上LacZ’的5’端有一段多克隆位点区，本身不干扰LacZ’的合成，但插入外源基因就会阻止LacZ’的合成。不能互补。 lacZ’ 5’ 3’ ?肽移码突变 lacZ’ 5’ 3’ ?肽 不互补 互补 MCS 外源DNA * 5) IPTG的诱导作用 IPTG是乳糖的类似物。能诱导Lac操纵子启动转录，使受体菌基因组中的LacZ 的C端部分(?-链)和载体的LacZ’?肽都表达，从而互补。 IPTG MCS无插入时，互补，蓝菌斑。 MCS有插入时，不互补，白菌斑。 蓝-白斑实验 * * 蓝色菌落条件： LacZ ?， LacZ ?M15，X-gal，IPTG LacZ野生型细菌 白色菌落条件： LacZ ?中插入外源基因（重组子） 无LacZ ?M15，无X-gal，无IPTG诱导 * 通过看培养皿上菌斑颜色就能知道是否有DNA插入。 未转化的菌不具有抗性，不生长； 转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落； 转化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成白色菌落。 牛痘病毒 埃博拉病毒 covalently closed circular? Open circular? linear 相似的复制子 * 第二章 基因工程载体系统 * 基因工程（gene engineering） 基因工程是指将一种或多种生物体 (供体) 的基因或基因组提取出来, 或者将人工合成的基因, 按照人们的愿望, 经过体外加工重组插入到载体分子中, 转移到另一种生物体 (受体) 的细胞内, 使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。 * 目的基因 克隆载体 工具酶 受体系统 载体功能： 1. 运送外源基因高效转入受体细胞2. 为外源基因提供复制能力或整合能力3. 为外源基因的扩增或表达提供条件 * 克隆载体 (cloning vector) 能够把外源DNA片段带入受体细胞并进行稳定遗传的DNA或RNA分子。 * 克隆载体具备的特性 1.能在宿主细胞内进行独立稳定的自我复制，或整合到染色 体DNA上随染色体DNA同步复制。 2. 具有多种单一的核酸内切酶切割位点，即多克隆位点MCS。 3.具有合适的筛选标记。 4.易于从宿主细胞中分离纯化出来， 以便于重组操作。 5.载体在细胞内稳定性高，保证重 组体稳定传代而不易丢失。 6.必须是安全的，不含对受体细胞 有害的基因。 * 按来源分:质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、高容量载体等 * 一、什么是质粒、质粒的特点 二、质粒的生物学特性 三、天然质粒的局限性 四、质粒做为载体的必备条件 五、主要的大肠杆菌质粒 第一节、质粒DNA * 质粒是存在于宿主细胞中的一类独立于染色体外能够进行自主复制的遗传单位。 Plasmid一词由Joshua Lederberg于1952年提出。 质粒的命名： 例:pBR322 p代表质粒; “BR”代表两位研究者 Bolivar和Rogigerus 姓氏的字首 “322”是实验编号 一、质粒概念、特点 1. 概念 * 细菌质粒是闭合、环形的双链DNA分子，大小1～200kb，质粒独立于细菌染色体之外，依赖于寄主细胞编码的酶来复制。 2. 质粒的特点 * 3.质粒DNA分子构型 具有三种不同的构型： 共价闭合环形DNA(cccDNA)：两条多核苷酸链均保持完整的环形结构，DNA呈超螺旋的SC构型。 开环DNA(ocDNA)：有一条保持完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型。 线性分子（lDNA)：经限制性内切酶切割之后，双链断裂而形成，称L构型。 * * Electrophoresis * 4. 质粒大小和拷贝数