肠道致病菌的微生物学检查幻灯片.ppt

实验五　肠道致病菌的微生物学检查结核分枝杆菌的培养及形态观察 实验内容： 1.肠道致病菌的微生物学检查 2.结核分枝杆菌的培养及形态观察 　　（抗酸染色） 1.肠道致病菌的微生物学检查 （1）实验目的 Aaaaaaaaaaaaaaaa 示教：常见肠道细菌 （2）常用培养基介绍 主要包括：麦康克培养基、伊红美蓝培养基、中国蓝琼脂平板、SS琼脂平板、双糖铁培养基 SS平板－分离肠道病原菌的强选择培养基 成分和作用： 基础培养基：提供氮源和碳源 胆盐、枸橼酸钠、煌绿：可抑制肠道非致病菌的生长，而对肠道致病菌抑制作用弱。 乳糖，中性红（pH6.8-8.0，红→橙黄） ：致病菌不分解乳糖，但分解蛋白胨产生碱性物质→菌落淡黄色；大肠杆菌分解乳糖产酸，菌落呈红色 病原菌:小,无色 非致病菌:大,红色 克氏双糖培养基 接种方法 如何观察 上层含乳糖部分 乳糖发酵：致病菌红色，非致病菌黄色 H2S 然后观察下层 发酵葡萄糖（产酸产气） 动力 （3）肠道致病菌的分离鉴定 ①标本收集 ②分离培养 ③初步鉴定 ④血清学鉴定 ⑤生化反应 鉴别肠道致病菌的生化反应 糖发酵试验 甲基红试验 VP实验 枸橼酸盐利用试验 硫化物（硫化氢）生成试验 吲哚生成试验 尿素水解试验 糖发酵试验(fermentaton test) Urease Test 尿素酶试验 ： 2.结核分枝杆菌的培养及形态观察 发病趋势和临床意义：aaaaaaaaa 结核分枝杆菌 形态： 细长，略弯曲的杆菌，多聚集成团。无鞭毛,芽胞。 染色性： 不易着色，齐尼抗酸染色阳性。菌体呈红色，背景中其他物质蓝色。 培养特性： 专性需氧，最适37℃ ，营养要求高，生长缓慢，18h分裂一代。罗氏(Lowenstein-Jensen)培养基含蛋黄、甘油、马铃薯、无机盐、孔雀绿，2~6周可见菌落生长，菜花、颗粒或结节状菌落，乳白色或黄色，不透明。在液体培养基，生长于表面，有皱褶。 结核分枝杆菌的培养方法 1．痰标本培养前处理 （1）酸处理法：痰标本加入4％硫酸稀释2～4倍，置室温下30min，期间振荡2～3次，使痰液化后即可接种。 （2）碱处理法：痰标本加入2％氢氧化钠溶液稀释2～4倍，置37℃温箱内30min，期间振荡2～3次，痰液化后即可接种。 2．接种培养法 取上述处理过的痰液0.1ml均匀接种于改良罗氏培养基斜面，37℃孵育3～4周后观察菌落特点。 菌落为乳白色或米黄色，表面粗糙呈颗粒状或菜花状 ?抗酸染色 结核杆菌对苯胺染料一般不易着色，但经加温或延长染色时间后能抵抗3％盐酸乙醇的脱色作用。经此法染色后，结核杆菌及其他分枝杆菌呈红色，非抗酸菌呈蓝色。 实验步骤： 1．用竹签挑取开放性肺结核病人晨痰标本中干酪样小粒或脓性部分，或用取菌环挑取经酸、碱处理后的痰标本，置载玻片中央，均匀涂布成1.5×2.0cm卵圆形痰膜，干燥，固定。 2．滴加石炭酸复红液于涂片上，玻片置于酒精灯火焰缓缓加热，至有蒸汽冒出，约维持5min（切勿沸腾或使染液干涸于玻片上）。如有染液干涸趋势，应补加染液。然后自然冷却，用流水漂去多于染液。 3．滴加3％盐酸乙醇脱色，至涂片较厚处无颜色脱出为止，约30s，水洗。 4．滴加碱性亚甲蓝液复染1min，水洗。 5．滤纸吸干后镜检。 实验材料 痰液1管/小组，抗酸染色染液1套/小组，玻片1个/人 实验报告内容 抗酸染色法 　实验原理、实验步骤、实验结果绘图和结果分析。 医学微生物学实验 示教：伊红美蓝培养基 双糖铁培养基 病原菌:透明,无色，小菌落 非致病菌:紫黑色 EMB（Eosin Methyl Blue)平板 ——分离肠道病原菌的弱选择培养基 乳糖 硫酸亚铁 固体 葡萄糖 半固体 指示剂:酚红 标本 选择鉴别培养基 SS平板 生化反应 血清学鉴定 双糖管等 已知Ab检测未知Ag (玻片凝集试验) 37℃ 24h ？和球菌的不同 粪便标本肠道致病菌 分离鉴别流程 乳糖 葡萄糖 动力 硫化氢 大肠杆菌 黄色 + - 痢疾杆菌 红色 + - - 伤寒杆菌 红色 + + +/- 示教：生化反应举例 示教：单糖发酵管 甲基红试验（methyl red test） - + - + VP（Voges-Proskauer）试验